阿特拉津降解菌株的筛选、分离及纯化探究

高桂凤，霍 勤，于加平，徐亚维，王俊玲，刘 波

（1吉林农业科技学院生物工程学院，吉林132101；2.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林132101）

阿特拉津降解菌株的筛选、分离及纯化探究

高桂凤1，霍 勤2，于加平1，徐亚维1，王俊玲1，刘 波1

（1吉林农业科技学院生物工程学院，吉林132101；2.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林132101）

本试验以长期使用阿特拉津除草剂的土壤为材料，通过设计特定的培养基来驯化长期使用阿特拉津的土壤微生物，并用涂布平板法分离纯化得到一株菌株，初步判断为阿特拉津降解菌；该菌株通过革兰氏染色，基因组DNA凝胶电泳、PCR分析得知：该菌为杆状，革兰氏染色为阳性，基因组长度为19000bp，16SrDNA长度为1700bp的菌株。

阿特拉津降解菌；筛选；特性分析

目前，在世界上销售的除草剂中，以三氮苯类、酰胺类、脲类、二硝基苯胺类等出售量最大，其中三氮苯类中以玉米用的阿特拉津使用量最多。阿特拉津（atrazine）的化学名称为2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪。它自从作为除草剂投入到商业化生产以来，因其生产成本低且除草效果好，而得到世界各国的普遍认可和使用，已成为世界上除草剂行业中销售量最大的重要除草剂。由于阿特拉津在世界范围内的广泛使用，由此而导致的环境污染问题已不容忽视。据资料报道，世界上具有多年阿特拉津使用历史的国家的地表水和地下水均受到了不同程度的污染。如加拿大[1]、德国[2-3]等国检测者对其饮用水、河流或对地下水或对土壤进行阿特拉津的残留及其衍生物的检测，发现其残留量均超出规定标准。我国的长江、黄河、辽河均检测到阿特拉津，北京官厅水库[4]、黄埔江源水[5]中等多地阿特拉津的含量均很高。阿特拉津的生理生态毒理学研究表明，阿特拉津可能对人体具有致癌性，长期接触阿特拉津会导致乳腺癌和卵巢癌的发生[6-7]。另外，研究表明阿特拉津对于生活在水中的动植物毒害性也极大[8-9]。

综上所述，关于环境中阿特拉津污染的治理引起各国普遍的关注，目前，对于污染的治理有许多种。其中，最为引人关注的是生物治理。本实验是从长期使用阿特拉津除草剂的土壤中通过训化、筛选、分离到一株能降解阿特拉津的菌株，并对其进行纯化，为下一步更加深入研究提供菌株资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要材料和试剂 长期施用阿特拉津除草剂的玉米地土壤（采集于吉林省东丰县），阿特拉津（浙江中山化工集团有限公司），NaCl，K2HPO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O，琼脂，结晶紫，碘液，石炭酸，复红，酒精等。

1.1.2 试验仪器 AL204-1C电子分析天平，MLS-3750高压灭菌器（日本三洋公司生产），SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化有限公司生产），XZQX100A恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司生产），WD800B微波炉（格兰仕公司生产），海尔电冰箱（广州海尔公司生产），光学显微镜，可见光分光光度计，培养箱，高速冷冻离心机，移液器，水平电泳槽，紫外/荧光观测仪。

1.2 试验方法

1.2.1 土样的加工 土样采自于长期使用阿特拉津除草剂的玉米地土壤，将采集到的土壤剔除沙粒、杂草，将块状土样碾细阴干后备用。

1.2.2 液体培养基及固体培养基的制备 将0.4% 的NaCl，1.79%的K2HPO4，0.45%的KH2PO4，0.2% 的MgSO4，配制成pH7.0基础盐培养基，通过高压蒸汽灭菌后使用；同时，取一定量上述液体培养基加入适量琼脂经灭菌后倒入平板，在倒平板之前，根据实验要求加入适量阿特拉津药品备用。

1.2.3 阿特拉津降解菌株的驯化、筛选 在超净工作台内，首先取一定量的土样加入到上述配好的液体基础盐培养基内混合均匀后在30℃培养箱中振荡培养。然后每隔7d从培养液中取一定量添加到新鲜的基础盐培养基中，同时新鲜培养基中阿特拉津的含量比前一次每100mL培养基中多10mg，直到每100mL培养基中阿特拉津的含量达到100mg为止，如此循环进行一段时间驯化后得到驯化菌种。

1.2.4 降解菌株的分离与纯化 将上述菌悬液结合吸光度值进行适当稀释，然后，选择合适稀释度，用涂布平板法在30℃培养箱中静置培养，直到菌落长出；然后，将其中的单个菌落重新转接到新鲜并且含有一定量阿特拉津的固体培养基上，就获得了纯培养物。

1.2.5 分离菌株基因组的提取及其基因组长度的推测 细菌基因组提取步骤：材料准备→破碎细胞或胞膜—内容物释放→核酸分离、纯化→沉淀或吸附核酸，并去除杂质→核酸溶解在适量缓冲液或水中，用琼脂糖凝胶电泳成像观察结果，并推测基因组长度。

1.2.6 用PCR法对分离菌株16SrDNA长度进行估测 进行PCR试验时，按添加的程序准备原料。首先通过查阅资料设计了分离菌株特异性的引物。引物的碱基顺序：A1、A2和A3的上游引物都是5’-cag agt ttg atc ctg gct cag-3’，下游引物分别是5’-cta cgg cta cct tgt tac g-3’，5’-agg agg tga tcc agc cgc a-3’，5’-ggt tac ctt gtt acg act t-3’；用1.2.4方法获得的基因组进行PCR。反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像观察进行估测。

1.2.7 DNA序列的测定 将1.2.6获得PCR产物用回收试剂盒进行回收，然后将回收产物送到上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2 结果分析

为了能分离到阿特拉津降解菌，本试验设计一种特殊的培养基，该培养基中碳源和氮源都是阿特拉津，因此，只有能降解阿特拉津的菌才能生长。初步判断分离到的菌株为阿特拉津降解菌，然后，选择一个单菌落在一个新鲜的固体培养基内进行划线培养，如此重复几次，就获得了纯培养物。

2.1 菌落特征观察见图1。

图1 固体培养基上阿特拉津降解菌的菌落

由图1可知，该菌株在含有阿特拉津的基础盐固体培养基表面菌落小，为圆形，表面光滑、湿润、粘稠、菌落为乳白色。在含有甘露醇和少量酵母膏的琼脂培养基表面，菌落稍大而厚。

2.2 降解菌的形态观察

用革兰氏染色法对分离到的菌株进行染色，经过显微镜观察发现该菌株的形态呈杆状，革兰氏染色为阳性菌。

2.3 分离菌株基因组的提取及其基因组长度的推测

为了进一步研究该菌株，从分离菌中提取到了基因组，并通过凝胶电泳成像进行分析，结果见图2，与marker比较，分离菌株基因组长度在19000bp左右。

图2 分离菌株基因组凝胶电泳成像图

2.4 用PCR法对分离菌株16SrDNA长度的分析

为了研究该菌株的16SrDNA，设计了三对引物用PCR去处理，然后，用凝胶电泳成像去分析。结果见图3，与marker比较，这三对引物的PCR产物A1、A2、A3差异不大，长度大约在1700bp左右。

图3 PCR产物凝胶电泳成像图

2.5 序列鉴定结果

为了进一步研究该菌株的16SrDNA的序列，对该菌株进行了DNA序列的测定，测定结果见图4。序列分析发现它与根瘤菌和农杆菌的相似度最高，达98%。

图4 降解菌株16SrDNA的序列

3 结论

本实验分离得到的菌株能在碳源和氮源只有阿特拉津存在的培养基中生长，初步判断分离到的菌株为阿特拉津降解菌。该菌株的基因组长度为19000bp左右、16SrDNA长度为1700bp左右，与根瘤菌和农杆菌的相似度高达98%的，杆状的、革兰氏阳性菌。

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[3]Khan S U.Supercritical fluid extraction of bound pesticide residues from soiland food commodities[J].JournalAgriculture Food Chemistry，1995（43）：1 718-1 721.

[4]任 晋，蒋 可，周怀东，等.官厅水库中阿特拉津残留的分析及污染来源[J].环境科学，2002，23（1）：126-128.

[5]马晓雁，高乃云，李青松，等.固相萃取-高效液相色谱检测原水中微量内分泌干扰物[J].给水排水，2006，32（1）：6-10.

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[9]El-sheekh，M.M.，H.M.Kotkat and O.H.F.Hammouda. Atrazine herbicide on growth，photosynthesis，protein synthesis，and fatty acid composition in the uniceller green algae Chlorella kessleri [J].Ectoxicol.Environ.Safty，1994（29）：319-358.

责任编辑：建德锋

Study on the Screening,Isolation and Purification of Atrazine Degrading Acteria

GAO Guifeng1，HUO Qin2，YU Jiaping1，XU Yawei1，WANG Junling1，LIU Bo1
（1.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Bioengineering,Jilin 132101;2.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Animal Science and Technology，Jilin 132101）

This experiment is to long-term use of herbicide atrazine in the soil for the material.With the specific design of medium to tame the long-term use of atrazine in the soil microorganiss,and separated by spread plate method to a strain,preliminaries judge for atrazine degrading bacteria.Analysised by gram staining,genomic DNA gel electrophoresis and PCR that the bacteria is rods,gram positive strain.The genome length is about 19000bp,the16SrDNA length is about 1700bp.

atrazine degrading microbe;screening;characteristic analysis

Q93

A

2016-11-11

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（吉教科合字[2014]第391号）

高桂凤（1971-），女，吉林省吉林市人，讲师，研究方向：微生物。