广西倒地铃体外抗氧化活性的谱效关系研究Δ

陈 君，陈 丽，韦建华（.广西科技大学医学院，广西柳州 545005；.广西中医药大学药学院，南宁53000）

广西倒地铃体外抗氧化活性的谱效关系研究Δ

陈 君1＊，陈 丽1，韦建华2（1.广西科技大学医学院，广西柳州 545005；2.广西中医药大学药学院，南宁530001）

目的：建立11批广西倒地铃的指纹图谱并考察其体外抗氧化活性的谱效关系，为揭示其抗氧化活性物质基础提供参考。方法：采用高效液相色谱法建立11批广西倒地铃的指纹图谱，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法测定不同产地倒地铃的体外抗氧化活性，并运用双变量相关性分析法考察倒地铃体外抗氧化的谱效关系。结果：11批广西倒地铃图谱的相似度均大于0.9，16个共有峰中2（原儿茶酸）、3、4、12号峰含量变化与DPPH自由基清除活性大小密切相关。结论：广西不同产地倒地铃的化学成分基本一致，但产地不同时质量有一定差异；原儿茶酸（2号峰）及3、4、12号峰代表的未知化合物可能是其抗氧化活性的药效物质基础。

广西；倒地铃；体外抗氧化活性；指纹图谱

倒地铃（Cardiospermum halicacabum L.）为无患子科倒地铃属植物，又名三角泡、假苦瓜、风船葛等，广泛分布于广西、广东、四川、贵州等地区，具有清热解毒、凉血、祛瘀、利尿等功效，民间多用于治疗百日咳、糖尿病、咽喉炎、皮肤湿疹、跌打损伤等[1-3]。中药化学成分的多样性与复杂性是其发挥疗效的物质基础，同时也是其质量评价的重点与难点。中药指纹图谱可以比较全面地反映中药所含的化学成分，但所展现的化学成分与药效的相关程度并不清楚。若将指纹图谱与中药药效评价相结合，找出与药效活性相关的药效成分群，确定相应的质控指标，可使构建的指纹图谱更有针对性地用于中药质量控制[4]。笔者前期研究表明，倒地铃全草中主要含有黄酮、三萜类、甾醇及有机酸等多种成分，并有显著的抗氧化活性[5-6]。在本研究中，笔者拟建立11批广西倒地铃药材的指纹图谱，并通过1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除试验考察其体外抗氧化作用，运用双变量相关性分析研究倒地铃共有色谱峰含量变化与DPPH自由基清除活性的关系，建立倒地铃药材体外抗氧化活性的谱效关系，为倒地铃的质量控制提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

1260高效液相色谱（HPLC）仪，包括四元低压梯度泵、在线真空泵、紫外检测器、Chemstation色谱工作站（美国安捷伦公司）；T6新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AL104电子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

1.2 对照品与试剂

原儿茶酸对照品（北京盈泽纳新化工技术研究院，批号：MUST-13103006，纯度：98.0%）；金圣草黄素、芹菜素对照品（自制，纯度：均＞98%）；DPPH（美国Sigma公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为市售分析纯，水为重蒸水。

1.3 药材

11批倒地铃药材为笔者亲自采收或购自来宾、百色靖西、玉林等药材市场，经广西中医药大学中药鉴定教研室廖月葵高级实验师鉴定均为无患子科植物倒地铃Cardiospermum halicacabum L.的干燥全草。倒地铃药材产地及采收时间见表1。

表1 倒地铃药材产地及采收时间Tab 1 The origin and harvest time of C.halicacabum

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil®ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（B）-0.1%磷酸溶液（A），梯度洗脱（0～10 min，95%A→80%A；10～30 min，67%A→30%A；30～45 min，30%A→5%A）；流速：1 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：30℃；进样量：10µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取原儿茶酸、金圣草黄素、芹菜素对照品适量，加甲醇溶解后定容至10 mL量瓶中，摇匀。再精密吸取各溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，再加甲醇溶解并定容，即得原儿茶酸、金圣草黄素、芹菜素质量浓度分别为13.4、17.2、15.2 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取不同产地倒地铃（S1～S11）粉末各约1 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入70%乙醇20 mL，密塞，称定质量。超声提取30 min，放冷后再称定质量，然后用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过。取上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 取空白溶剂（70%乙醇）和倒地铃药材（S2）的供试品溶液各1份，按“2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，记录色谱图。结果，空白溶剂不干扰测定，各色谱峰分离度均大于1.5，表明该方法专属性较好。

2.3.2 精密度 取倒地铃药材（S2）的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录色谱图。以芹菜素的保留时间与峰面积为参照，换算出各共有峰相对保留时间的RSD值均小于1%（n＝5），相对峰面积的RSD值均小于3%，表明方法采用的HPLC仪器及整体系统精密度良好。

2.3.3 重复性 取同一批倒地铃（S2）药粉5份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以芹菜素的保留时间与峰面积为参照，换算出各共有峰相对保留时间的RSD值均小于1%（n＝5），相对峰面积的RSD值均小于3%（n＝5），表明该方法重复性较好。

2.3.4 稳定性 取倒地铃药材（S2）的供试品溶液，于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”项下色谱条件条件进样测定，记录色谱图。以芹菜素的保留时间与峰面积为参照，换算出各共有峰相对保留时间的RSD值均小于1%（n＝5），相对峰面积的RSD值均小于3%（n＝5），表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.4 指纹图谱的研究[7-9]

2.4.1 HPLC图谱的建立及特征峰的指认 取不同产地的倒地铃（S1～S11）粉末，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。比较11批倒地铃样品的色谱图，确立了倒地铃药材共有峰16个。其中芹菜素的信号强度适中，分离度和峰形较好，在各个不同来源的倒地铃药材样品中均含有此峰且较稳定，因此以其为参照峰。将混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进样分析，进行峰位定位，确定供试品图中2号峰是原儿茶酸、14号峰是芹菜素、15号峰是金圣草黄素。11批倒地铃药材指纹图谱及对照图谱见图1，S2样品及混合对照品的HPLC图谱见图2。

图1 11批倒地铃药材指纹图谱及对照图谱Fig 1 Fingerprints and reference fingerprint of 11 batches of C.halicacabum

图2 倒地铃S2样品及混合对照品的HPLC图谱Fig 2 HPLC chromatograms of S2 sample of C.halicacabum and mixed reference substance

2.4.2 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（中国药典委员会2004A）对11批倒地铃药材的色谱数据进行处理，以样品S2的图谱为参照，采用中位数法，按Mark峰进行自动匹配生成倒地铃对照指纹图谱。将该对照指纹图谱的相似度定为1，计算出11批倒地铃指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.9，表明11批药材在化学成分的组成上基本一样。

2.4.3 聚类分析 应用SPSS 22.0统计学软件，以11批不同产地倒地铃的HPLC指纹图谱中16个共有峰的相对峰面积，采用欧氏距离进行聚类分析，将11批不同产地的倒地铃大致划分为两大类，6号样品为第Ⅱ类，其他样品均为第Ⅰ类，结果见图3。

图3 11批倒地铃指纹图谱的聚类分析树状图Fig 3 Cluster analysis dendrogram of the fingerprints of 11 batches of C.halicacabum

2.5 体外抗氧化活性测定

2.5.1 DPPH溶液的制备 精密称定DPPH适量，加95%乙醇定容至50 mL量瓶中，即得DPPH质量浓度为0.057 mg/mL的溶液，低温避光保存。

2.5.2 DPPH自由基清除率的测定 按“2.2.2”项下方法制备倒地铃（S1～S11）的供试品溶液，分别精密吸取0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、3.0 mL溶液，用70%乙醇溶解并定容至10 mL，摇匀，制成6个系列质量浓度的样品溶液。精密吸取各样品溶液2 mL，分别加入2 mL的DPPH溶液，摇匀，避光放置30 min，于517 nm波长处测定溶液的吸光度（A），计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（%）＝[A0－（A1－As）]/A0×100%（其中，A0为2 mL DPPH溶液+2 mL 70%乙醇的A；A1为2 mL DPPH溶液+ 2 mL样品溶液的A；As为2 mL 70%乙醇+2 mL样品溶液的A[10]）。以样品溶液质量浓度为横坐标、DPPH自由基清除率为纵坐标，采用Probit模型计算清除DPPH自由基的半数清除浓度（IC50）。结果，样品S1～S11对DPPH自由基均有明显的清除活性，且随着样品质量浓度的增大而增大（详见图4），IC50值分别为1.60、0.86、0.95、0.99、2.30、2.61、1.34、1.11、0.45、1.41、4.88 mg/mL。结果提示，11批倒地铃的抗氧化作用明显，其中样品S11的作用相对较弱，S9作用最强。

2.6 指纹图谱与抗氧化活性的谱效关系分析

应用SPSS 22.0统计学软件，对16个共有峰峰面积与倒地铃的IC50进行双变量相关分析。结果，16个特征色谱峰中2号峰（原儿茶酸）含量变化与DPPH自由基清除活性呈非常显著的负相关（P＜0.01）；3、4、12号峰含量变化与DPPH自由基清除活性呈显著的负相关（P＜0.05）。特征指纹峰与抗氧化活性的相关系数测定结果见表2。

图4 11批倒地铃抗氧化活性测定结果Fig 4 Determination results of antioxidant activity of 11 batches of C.halicacabum

表2 特征指纹峰与抗氧化活性的相关系数测定结果Tab 2 Determination of correlation coefficient between characteristic fingerprint peak and antioxidant activity

3 讨论

本研究采用HPLC法建立了广西11批倒地铃的指纹图谱，使倒地铃的共有成分在色谱图中得以体现；结合相似度评价和聚类分析可知，11批药材的相似度大于0.9，16个共有峰的相对保留时间符合程度较好，化学成分的组成基本一致；但相对峰面积差别较大，说明不同产地倒地铃药材质量存在一定的差异。同时，本研究以DPPH自由基清除法比较了不同产地倒地铃样品溶液的抗氧化作用。结果表明倒地铃样品溶液抗氧化作用明显；结合倒地铃的指纹图谱进行谱效关系研究，得出2、3、4、12号峰与抗氧化作用相关性显著。然而本研究只鉴定出2号峰为原儿茶酸，3、4、12号峰为何种化合物还需进一步考察。

[1] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编：下册[M].2版.北京：人民卫生出版社，1996：513.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典：下册[M].上海：上海人民出版社，1977：3862.

[3] 中华本草编委会.中华本草：第5卷[M].上海：上海科学技术出版社，1999：3969.

[4] 邓书鸿，聂磊.中药谱效关系的分析方法及数据处理技术研究进展[J].中药材，2010，33（11）：1819-1823.

[5] 韦建华，陈君，蔡少芳，等.倒地铃化学成分研究：1[J].中草药，2011，42（8）：1509-1511.

[6] 陈君，韦建华，蔡少芳，等.倒地铃有效部位化学成分研究[J].中药材，2013，36（2）：228-230.

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Study on the Spectrum-effect Relationship of Antioxidant Activity in vitro of Cardiospermum halicacabum from Guangxi

CHEN Jun1，CHEN Li1，WEI Jianhua2（1.School of Medicine，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi Liuzhou 545005，China；2.School of Pharmacy，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

OBJECTIVE：To establish the fingerprints of 11 batches of Cardiospermum halicacabum from Guangxi，and detect its spectrum-effect relationship of antioxidant activity in vitro，and provide reference for revealing the material basis for its antioxidant activity.METHODS：HPLC was conducted to establish the fingerprints of 11 batches of C.halicacabum from Guangxi，the 1，1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine（DPPH）free radical scavenging method was used to determine the antioxidant activity in vitro of C.halicacabum from different origins，and bivariate correlation analysis was adopted to detect the spectrum-effect relationship of antioxidant activity in vitro.RESULTS：The similarities of 11 batches of C.halicacabum from Guangxi were all more than 0.9，and the content change of peak 2（protocatechuic acid），3，4，12 in 16 common peaks was closely related to the DPPH free radical scavenging activity.CONCLUSIONS：The chemical composition of C.halicacabum from different origins in Guangxi is basically consistent，while there are some differences in the quality of the producing area.The protocatechuic acid（peak 2）and the unknown compounds represented by peak 3，4，12 may be the pharmacodynamic material basis of its antioxidant activity.

Guangxi；Cardiospermum halicacabum；Antioxidant activity in vitro；Fingerprint

R932

A

1001-0408（2017）07-0906-04

2016-08-24

2016-11-06）

（编辑：林 静）

广西高校科学技术研究项目（No.2013YB287）

＊副教授，硕士。研究方向：中药、民族药的有效成分与质量标准。电话：0772-2056026。E-mail：lzyzchenjun@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.12