祛风消癜合剂UHPLC指纹图谱的建立

凌 霄 张 辉 李伟霞牛 璐唐进法*任献青

（1.河南中医药大学第一附属医院，中药临床评价技术河南省工程实验室，河南郑州 450000；2.河南中医药大学，呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南郑州 450006；3.河南中医药大学第一附属医院儿科，河南郑州 450000）

过敏性紫癜常见于儿童,相当一部分患儿由于其反复发作而引起肾脏病变等其他严重并发症［1-2］,故研发合适的药物以降低该疾病发病率、预防重要器官损伤是亟需解决的问题。研究表明,风热伤络证是过敏性紫癜常见证型［3］,针对其特征,河南中医药大学第一附属医院儿科专家根据长期临床经验总结研制了祛风消癜方,由忍冬藤、荆芥、防风、徐长卿、茜草、海风藤、丹参、炙甘草组成,方中忍冬藤善于清热疏风通络,荆芥长于透疹止血,共为君药；防风祛风止痒,海风藤深入经络,祛除风邪,共为臣药；配以徐长卿祛风止痒,丹参祛瘀生新、凉血活血,茜草凉血止血、化瘀通经,共为佐药；甘草泻火解毒、调和诸药,为使药,诸药相伍,用于过敏性紫癜辨证属风热伤络者,其疗效显著,不良反应小［4-5］。祛风消癜合剂是在祛风消癜方基础上开发的院内制剂,本实验建立其UHPLC指纹图谱,以期为全面评价和控制其质量提供依据。

1 材料

XS105型电子天平 （十万分之一,瑞士Mettler-Toledo公司）；UHPLC-Q-TOF-MS系统,配置ACQUITY-UHPLC型高效液相色谱仪、电喷雾离子源XEVO-G2XSQTOF飞行时间质谱、Acquity UHPLC H-Class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ-100DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

马钱苷 （纯度＞98%,批号R23D7F27552）、5-O-甲基维斯阿米醇苷 （纯度＞98%,批号P05M8F35478）、原儿茶醛 （纯度＞98%,批号P05M7F14533）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；新绿原酸 （纯度 ＞ 98%,批号lw190124015）对照品购于南京良纬科技有限公司；甘草苷（纯度＞98%,批号PRF8110742）对照品购于成都普瑞法科技开发有限公司；绿原酸（纯度96.8%,批号110753-201817）、槲皮苷（纯度90.6%,批号111538-201606）、橙皮苷 （纯度96.2%,批号110721-201818）、丹酚酸B （纯度96.6%,批号111562-201917）、丹皮酚 （纯度99.8%,批号110708-201908）、甘草酸铵 （纯度97.7%,批号110731-201720）对照品均购于中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

祛风消癜合剂共12批,均由医院制剂室制备（批号分 别为 20181124、20181127、20181201、20190311、20190315、20190328、20191118、20191215、20200121、20200206、20200208、20200301）,编号S1～S12。忍冬藤（批号1809080172）购于湖北天济中药饮片有限公司；荆芥（批号1805282）、防风（批号1807171）、徐长卿 （批号1804112）、海风藤（批号1805192）、丹参（批号1807231）均购于安徽普仁中药饮片有限公司；茜草（批号180916）、炙甘草（批号180916）均购于安徽人民中药饮片有限公司,经河南中医药大学第一附属医院药检室施钧瀚副主任药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UHPLC CSH C18色谱柱 （2.1 mm×100 mm,1.7 μm）；流动相0.2%磷酸（A）-乙腈（B）,梯度洗脱（0～5 min,5%B；5～30 min,5%～22%B；30～45 min,22%～95%B；45～47 min,95% B；48～50 min,95%～5%B）；体积流量0.3 mL/min；柱温25 ℃；检测波长236 nm；进样量1 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）,正、负离子扫描模式；毛细管电压2 500 V；锥孔电压40 V；脱溶剂气温度250 ℃,体积流量600 L/h；离子源温度100 ℃,锥孔气体积流量50 L/h；亮氨酸-脑啡肽（正离子模式m/z556.277 1,负离子模式m/z554.261 5）溶液在线校正,扫描质量100～1000 Da,全扫描模式。采用Waters UNIFI软件对采集数据进行处理。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液 取马钱苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、原儿茶醛、新绿原酸、甘草苷、绿原酸、槲皮苷、橙皮苷、丹酚酸B、丹皮酚、甘草酸铵对照品各约1 mg,精密称定,甲醇制成1 mg/mL贮备液,再进一步稀释至0.05 mg/mL,即得。

2.3.2 供试品溶液 精密吸取12批样品,每批2 mL,甲醇定容至10 mL量瓶中,超声提取20 min,各吸取10 mL至离心管中,150 000 r/min离心5 min,取上清液,过0.22 μm微孔滤膜,即得。

2.3.3 阴性样品溶液 按照处方比例及工艺流程,制备缺忍冬藤、缺荆芥、缺防风、缺徐长卿、缺茜草、缺海风藤、缺丹参、缺炙甘草的阴性样品,按“2.3.2” 项下方法制备,即得。

2.3.4 单味药材溶液 按照处方比例,称取忍冬藤、荆芥、防风、徐长卿、茜草、海风藤、丹参、炙甘草8种单味药材,按“2.3.2” 项下方法制备,即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液（S4）,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次,以14号峰（升麻素苷）为对照,测得各共有峰相对峰面积RSD为1.17%～2.86%,相对保留时间RSD为0.03%～0.82%,表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液（S4）,分别于0、3、6、12、18、24 h,在“2.1”项色谱条件下进样测定,以14号峰（升麻素苷）为对照,测得各共有峰相对峰面积RSD为1.02%～2.92%,相对保留时间RSD为0.03%～1.11%,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取合剂（S4）6份,按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,以14号峰（升麻素苷）为对照,测得各共有峰相对峰面积RSD为1.19%～2.82%,相对保留时间RSD为0.04%～1.52%,表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱建立 取12批样品,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,将所得图谱以CDF格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）进行分析,自动多点匹配法生成对照图谱,计算相似度,结果见图1、表1。由此可知,各批样品相似度均大于0.97；有24个共有峰,分离度均大于1.5,其中14号峰（升麻素苷）峰面积较高,出峰时间稳定适中,分离度良好,故选择其作为对照峰。各共有峰相对保留时间RSD为0.05%～1.15%,总体上较稳定；相对峰面积RSD为3.83%～29.62%,上下浮动较大,表明个别成分在不同批次样品中的含有量有较大差异。

图1 12批样品UHPLC指纹图谱Fig.1 UHPLC fingerprints for twelve batches of samples

表1 12批样品相似度Tab.1 Similarities of twelve batches of samples

2.6 共有峰指认和归属 将对照品、供试品溶液色谱图叠加,比对两者保留时间,指认出4、5、8、10、14、15、17、18、19、22、23、24号峰分别为新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、马钱苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲维阿斯米醇苷、槲皮苷、橙皮苷、丹酚酸B、丹皮酚、甘草酸,见图2。

对其余未指认出的共有峰,在分离后不经检测器而直接接取其出峰时间前0.5 min至出峰时间后0.5 min的洗脱液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定10次,于氮气流下吹干,残留物用200 μL甲醇复溶,涡流2 min,15 000 r/min离心10 min,上清液采用UHPLC-TOF-MS法进行分析,通过Waters UNIFI软件对所采集数据进行处理,将碎片离子信息与对照品图谱和相关文献作比对,其裂解规律见图3,鉴定结果见表2。

图2 各成分UHPLC色谱图（Ⅰ）Fig.2 UHPLC chromatograms of various constituents （Ⅰ）

图3 各成分质谱裂解规律Fig.3 MS fragmentation patterns for various constituents

表2 未知共有峰鉴定结果Tab.2 Results of unknown common peak identification

由此可知,3号峰一级质谱准分子离子峰为m/z179.034 8 ［M-H］-,苯环上邻二酚羟基脱水后生成碎片离子m/z161,再脱羧失去CO2,生成碎片离子m/z135,与对照品和文献［6-7］比对后推测其为咖啡酸；11号峰一级质谱准分子离子峰为m/z403.124 5 ［M-H］-,脱去一分子葡萄糖后生成碎片离子m/z223,再脱去一分子CO2和乙酰氧基,生成碎片离子m/z121,与对照品和文献［8］比对后推测其为断氧化马钱苷；21号峰一级质谱准分子离子峰为m/z461.072 9 ［M-H］-,从苷键处脱去一分子葡萄糖醛酸,生成碎片离子m/z285,与对照品和文献［9］比对后推测其为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；20号峰一级质谱准分子离子峰为m/z359.076 9 ［M-H］-,酰氧键断裂,生成碎片离子m/z179,苯环上邻二酚羟基脱水,生成碎片离子m/z161,与对照品和文献［10］比对后推测其为迷迭香酸；7号峰一级质谱准分子离子峰为m/z477.081 2 ［M-H］-,脱去一分子糖苷,生成碎片离子m/z315,与对照品和文献［11］比对后推测其为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

将单味药材、阴性样品溶液色谱图进行比对,发现各药材色谱峰均与合剂共有峰对应,表明单味药材与合剂化学信息的相关性良好。其中,1、3、4、6、9、10、11、13号峰归属于忍冬藤,12号峰归属于海风藤,14、17号峰归属于防风,15、24号峰归属于炙甘草,19号峰归属于荆芥,21、22号峰归属于丹参,23号峰归属于徐长卿；2号峰为荆芥、丹参、防风共有,18号峰为丹参、忍冬藤共有,5号峰为荆芥、忍冬藤、丹参共有,20号峰为荆芥、丹参共有,7号为忍冬藤、茜草共有,8号为忍冬藤、荆芥共有,16号峰为防风、炙甘草共有。色谱图见图4。

图4 各成分UHPLC色谱图（Ⅱ）Fig.4 UHPLC chromatograms of various constituents （Ⅱ）

2.7 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）采用PLS-DA对24个共有峰的相对峰面积进行判别分析,得分图 ［R2X（cum）=0.87,Q2（cum）=0.964］见图5,可知12批样品可按生产年份聚为3类,即2018年产（S1～S3）、2019年产（S4～S8）、2020年产（S9～S12）；载荷图见图6,可知11、16、7、6、1、22、4、15、8、13、19、18、21号峰的圆形距离原点较远,表明这些成分对分组贡献较大；VIP见图7,可知大于1的有10种,分别为5号峰（原儿茶醛）、2号峰、18号峰（槲皮苷）、21号峰（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）、19号峰（橙皮苷）、15号峰（甘草苷）、22号峰（丹酚酸B）、13号峰、4号峰（新绿原酸）、1号峰,但其相对峰面积均在2018年产样品中最低,而18、21、19、15、13号峰在2019年产样品中最高,5、2、22、4号峰在2020年产样品中最高。综上所述,造成不同年份样品质量差异的主要成分为槲皮苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B、新绿原酸、13号峰、1号峰。

图5 12批样品PLS-DA得分图Fig.5 PLS-DA score plot for twelve batches of samples

3 讨论

图6 12批样品PLS-DA载荷图Fig.6 PLS-DA loading plot for twelve batches of samples

图7 共有峰相对峰面积VIP图Fig.7 VIP diagram for relative peak areas of common peaks

本实验对色谱条件进行了考察,发现Waters ACQUITY UHPLC CSH C18色谱柱 （2.1 mm ×100 mm,1.7 μm）分离效果最好；乙腈-0.2% 磷酸洗脱时各成分色谱峰分离度较好,出峰时间适中；不同柱温（25、30、35 ℃）差别不大；体积流量0.3 mL/min时洗脱效果最好；采用DAD检测器在190～400 nm波长处进行扫描,发现236 nm处色谱峰数量最多,峰高度合适,故选择其作为检测波长。再对供试品溶液制备方法进行了考察,发现超声提取效果明显优于冷浸,而且15 mL甲醇提取20 min时,只需1次各成分即已基本提取完全。

本实验建立了祛风消癜合剂UHPLC指纹图谱,确定了24个共有峰的药材来源归属和其中17个的化学成分归属,但海风藤、茜草信号较弱,专属峰较少,将在今后研究中加以改进。PLS-DA显示,不同年份样品在整体质量上存在一定差异,原儿茶醛、槲皮苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B、新绿原酸可作为差异标志物,其中原儿茶醛、新绿原酸、丹酚酸B相对峰面积随着贮藏时间延长逐渐降低。新绿原酸、原儿茶醛是君药忍冬藤标志性成分,具有较好的抗氧化、抗炎作用,但其结构中有酯键、不饱和双键、多元酚等不稳定部分［12-13］；丹酚酸B具有较强的抗氧化、清除自由基作用,是臣药丹参重要功效成分,但其性质也不稳定［14-15］,这些化合物含有量差异可能是造成不同年份样品质量存在差异的主要原因之一,提示祛风消癜合剂在贮藏过程中需要关注成分的稳定性。因此,建议对祛风消癜合剂进行品质评价时应增加新绿原酸、原儿茶醛、丹酚酸B等稳定性较差成分的含有量测定,以期最大程度保证该制剂质量。