重组人p53腺病毒注射液对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡及自噬的影响Δ

仲智勇，时保军，周 辉，王文博（河北医科大学第二医院小儿外科，石家庄 050017）

重组人p53腺病毒注射液对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡及自噬的影响Δ

仲智勇＊，时保军，周 辉，王文博（河北医科大学第二医院小儿外科，石家庄 050017）

目的：研究重组人p53腺病毒注射液对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法：将肾母细胞瘤细胞分别与高、中、低浓度（1×109、1×108、1×107VP/mL）的重组人p53腺病毒注射液共同孵育20 h，以不加注射液的细胞为空白对照。检测细胞增殖、周期、凋亡及相关基因p21、Bax蛋白表达，检测细胞中自噬相关基因LC-3、Atg7、Atg12表达和自噬体数量。结果：高、中、低浓度重组人p53腺病毒注射液对肾母细胞瘤细胞的增殖抑制率分别为（42.86±3.18）%、（33.64±7.25）%、（16.26±9.07）%，细胞凋亡率分别为（53.85±9.36）%、（37.35±9.64）%、（23.64±10.65）%。与空白对照比较，高、中、低浓度药物作用下G0/G1期细胞均增加，其中高、中浓度药物效果较明显（P＜0.05或P＜0.01）；高浓度下细胞中p21、Bax蛋白和LC-3、Atg7、Atg12基因表达增强，自噬体数量增加（P＜0.01）；中浓度下细胞中Bax蛋白表达增强（P＜0.05），其余指标无明显变化（P＞0.05）。结论：重组人p53腺病毒注射液可抑制肾母细胞瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬。

肾母细胞瘤；重组人p53腺病毒注射液；细胞周期；增殖；凋亡；自噬

肾母细胞瘤是儿童常见的恶性肿瘤性疾病之一，发病率在小儿肿瘤中高居第5位，手术切除并予以辅助化疗是其主要治疗手段[1]。但对于病理分型为间变型等的肾母细胞瘤预后不良型的治疗，受到目前临床治疗手段的限制，疗效一直不稳定[2]。

重组人p53腺病毒（rAd-p53）注射液是以现代生物医学工程技术为基础，通过生物重组而制备的一类具有代表性的病毒颗粒注射液。有研究表明，rAd-p53注射液可以通过调节细胞凋亡过程对多种肿瘤起到治疗作用[3-4]。近年研究发现，自噬与细胞的凋亡有着密切的联系，二者可以相互调控。本文主要研究rAd-p53注射液对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡及自噬的影响。

1 材料

1.1 仪器

CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）；DM0412低速离心机（美国赛洛捷公司，离心半径：4 cm）；LSM 880激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）；JEM-1400透射电镜（日本JEM公司）；Tanon 5500化学发光仪（上海天能科技有限公司）；Multiskan MK3酶标仪、ABI7500荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR）仪（美国Thermo公司）；FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 药品与试剂

rAd-p53注射液（深圳市赛百诺基因技术有限公司，批号：20151003，规格：1×1012VP/支）；RPMI 1640培养液及胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁公司）；细胞周期、细胞凋亡试剂盒（四正柏生物技术有限公司）；兔p21（细胞周期相关基因）、Bax（凋亡相关基因）、LC-3（自噬相关基因）抗体及山羊抗兔二抗（美国Abcam公司）；增强化学发光（ECL）液（德国Milipore公司）；LC-3荧光标记试剂盒（美国Ebioscience公司）；所有化学试剂均为国产分析纯。

1.3 细胞

肾母细胞瘤细胞由中国科学院细胞所提供。

2 方法

2.1 给药浓度的选择

以预试验结果为依据，本试验的Ad-p53高、中、低浓度分别设定为1×109、1×108、1×107VP/mL，rAd-p53注射液用含有10%FBS的RPMI 1640培养液进行稀释；以含有10%FBS的RPMI 1640培养液为空白对照。

2.2 肾母细胞瘤的培养

肾母细胞瘤细胞从液氮中取出后，迅速置于37℃水浴中，摇晃解冻，1 000 r/min离心3 min，去上清，转移细胞至培养瓶中，于37℃、5%CO2条件下培养。待细胞生长至密布瓶底约80%以上，加入500 μL胰酶消化细胞，加入新培养液终止消化，1 000 r/min离心3 min，重悬细胞至合适浓度后进行下一步试验操作。

2.3 rAd-p53注射液对肾母细胞瘤细胞增殖的影响

取传一代后的肾母细胞瘤细胞，取1×104个细胞接种于96孔板中，培养至对数生长期，加入适量rAd-p53注射液使其终浓度分别为1×109、1×108、1×107VP/mL（高、中、低浓度组），每个浓度设6个复孔。于37℃、5% CO2条件下培养20 h后，按照CCK-8试剂盒检测并计算细胞增殖抑制率，同时以含有10%FBS的RPMI 1640培养液培养为空白对照组。

2.4 rAd-p53注射液对肾母细胞瘤细胞周期和凋亡的影响

取传一代后的肾母细胞瘤细胞，取1×105个细胞接种于96孔板中，加入适量rAd-p53注射液使其终浓度分别为1×109、1×108、1×107VP/mL（rAd-p53高、中、低浓度组），每个浓度设6个复孔。培养20 h后，制备成细胞悬液，按照试剂盒要求加入碘化丙啶（PI）及异硫氰酸荧光素（FITC），采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况，计算凋亡率，同时以含有10%FBS的RPMI 1640培养液培养为空白对照组。

2.5 rAd-p53注射液对肾母细胞瘤细胞中p21、Bax蛋白表达的影响

同“2.4”项下方法分组、培养细胞20 h后，胰蛋白酶消化细胞，冰浴超声（200 W，10 s/次，共3次）破解细胞，提取总蛋白。总蛋白上样量为30 μg，使用7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V电泳30 min至平行后，使用120 V电泳90 min，200 mA恒流转膜90 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔p21、Bax抗体（稀释比例为1∶500），4℃孵育过夜；第2天洗膜后，加入山羊抗兔二抗（稀释比例为1∶1 000），室温孵育2 h，洗膜，ECL曝光，记录数据。采用Image J软件分析条带光密度，以目标蛋白与内参β-肌动蛋白（β-actin）比值评价目标蛋白的相对表达量。

2.6 rAd-p53注射液对肾母细胞瘤细胞自噬的影响

2.6.1 自噬相关基因LC-3表达 取传一代后的肾母细胞瘤细胞，取1×104个细胞接种于激光共聚焦专用皿中，加入适量的rAd-p53注射液使其终浓度分别为1×109、1× 108、1×107VP/mL（高、中、低浓度组），每个浓度设3个复孔。培养20 h后，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞后使用4%多聚甲醛固定细胞，3%牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性抗原，加入10 μg/mL兔LC-3抗体孵育细胞24 h。清洗后使用FITC荧光标记二抗孵育2 h，激光共聚焦显微镜拍照记录数据，每孔拍摄3个视野，同时以含有10%FBS的RPMI 1640培养液培养为空白对照组。

2.6.2 自噬相关基因Atg7、Atg12表达 同“2.4”项下方法分组、培养细胞20 h后，吸去培养液，加入Trizol裂解细胞提取总RNA，按照Takara试剂盒说明书反转录为mRNA，并采用Q-PCR法检测Atg7、Atg12基因的表达情况，每个浓度设6个复孔。扩增条件：95℃、15 min；94℃、15 s，40个循环；62℃、60 s。引物序列：Atg7上游引物为5′-GAGGAGACCGTCTGAGCAAC-3′，下游引物为5′-TGACACAGGAAGGTGCAA-3′，扩增长度为131 bp；Atg12上游引物为 5′-AAACGTGAGCCAAGGGATT-3′，下游引物为5′-AAACGTGAGCCAAGGGATT-3′，扩增长度为132 bp；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）上游引物为5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物为5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′，扩增长度为325 bp。数据使用2－ΔΔct法分析，ΔΔct＝Δct给药组－Δct空白对照组，Δct＝ct目标产物－Δct内参。

2.6.3 自噬体数量 同“2.4”项下方法分组、培养细胞20 h后，胰蛋白酶消化细胞，2.5%中性戊二醛固定4 h，用PBS漂洗6次，加1%锇酸固定2 h，乙醇梯度脱水并使用树脂渗透，包埋，切片（厚度为50～70 nm），铀铅双染色后，透射电镜观察自噬体数量的变化。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 细胞增殖抑制率

高、中、低浓度rAd-p53注射液对肾母细胞瘤细胞的增殖抑制率分别为（42.86±3.18）%、（33.64±7.25）%、（16.26±9.07）%。与空白对照组比较，rAd-p53中、高浓度组细胞的增殖抑制率明显升高（P＜0.01）；rAd-p53高、中、低浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 细胞周期和凋亡率

与空白对照组比较，rAd-p53高、中浓度组G0/G1期细胞明显增加（P＜0.05或P＜0.01），rAd-p53高、中、低浓度组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。各组细胞周期变化和凋亡率测定结果见表1。

表1 各组细胞周期变化和凋亡率测定结果（±s，n＝6）Tab 1 Changes of cell cycle and determination results of apoptosis rate in each group（±s，n＝6）

表1 各组细胞周期变化和凋亡率测定结果（±s，n＝6）Tab 1 Changes of cell cycle and determination results of apoptosis rate in each group（±s，n＝6）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

凋亡率，% 5.27±1.64 53.85±9.36＊＊37.35±9.64＊＊23.64±10.65＊组别空白对照组rAd-p53高浓度组rAd-p53中浓度组rAd-p53低浓度组G0/G1，% 61.66±3.84 81.74±4.76＊＊73.46±5.73＊66.32±6.86 S，% 23.75±1.85 9.54±0.97＊＊14.75±2.87＊22.85±4.86 G2/M，% 14.09±1.01 8.12±1.89＊11.39±5.25 10.13±3.15

3.3 p21、Bax蛋白表达

与空白对照组比较，rAd-p53高浓度组细胞中p21和Bax蛋白表达增强（P＜0.01），rAd-p53中浓度组细胞中Bax蛋白表达增强（P＜0.05），其余差异无统计学意义（P＞0.05）。各组细胞中p21、Bax蛋白表达的电泳图见图1，测定结果见表2。

图1 各组细胞中p21、Bax蛋白表达的电泳图Fig 1 Electrophoresis graphs of p21，Bax protein expressions of cells in each group

表2 各组细胞中p21、Bax蛋白表达测定结果（±s，n＝6）Tab 2 Determination results of p21，Bax protein expressions of cells in each group（±s，n＝6）

表2 各组细胞中p21、Bax蛋白表达测定结果（±s，n＝6）Tab 2 Determination results of p21，Bax protein expressions of cells in each group（±s，n＝6）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

Bax/β-actin 0.998±0.001 1.455±0.107＊＊1.267±0.054＊1.065±0.647组别空白对照组rAd-p53高浓度组rAd-p53中浓度组rAd-p53低浓度组p21/β-actin 1.021±0.009 1.365±0.042＊＊1.127±0.153 0.995±0.264

3.4 自噬情况

3.4.1 LC-3基因表达 与空白对照组比较，rAd-p53高浓度组细胞中LC-3荧光增多，rAd-p53中、低浓度组细胞中LC-3荧光无明显变化。各组细胞中LC-3基因表达荧光图见图2。

图2 各组细胞中LC-3基因表达荧光图（FITC，×400）Fig 2 Fluorescence graphs of LC-3 gene expression of cells in each group（FITC，×400）

3.4.2 Atg7、Atg12基因表达 与空白对照组比较，rAdp53高浓度组细胞中Atg7、Atg12基因表达增强（P＜0.01），表明细胞自噬的基因启动，细胞自噬显著性增加；其余组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组细胞中Atg7、Atg12基因表达的测定结果见表3。

表3 各组细胞中Atg7、Atg12基因表达的测定结果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results of Atg7，Atg12 gene expressions of cells in each group（±s，n＝6）

表3 各组细胞中Atg7、Atg12基因表达的测定结果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results of Atg7，Atg12 gene expressions of cells in each group（±s，n＝6）

注：与空白对照组比较，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01

Atg12/GAPDH 1.015±0.008 2.287±0.211＊＊1.333±0.624 1.098±0.274组别空白对照组rAd-p53高浓度组rAd-p53中浓度组rAd-p53低浓度组Atg7/GAPDH 1.001±0.012 1.928±0.173＊＊1.264±0.521 1.173±0.324

3.4.3 自噬体数量 与空白对照组比较，rAd-p53高浓度组细胞内自噬体数量明显增加，rAd-p53中、低浓度组细胞内自噬体数量无明显变化，表明高浓度rAd-p53注射液可以促进细胞自噬的发生。各组细胞自噬体的透射电镜图见图3。

4 讨论

自1995年9月美国FDA批准第一个p53基因治疗的临床试验方案，现临床研究已证实rAd-p53制品采用多种给药方式均可以治疗多种恶性肿瘤，并且安全[5]。从调查研究中发现，多数恶性肿瘤有p53基因突变，同时，rAd-p53注射液对多种不同类型的肿瘤均表现出很强的抑制作用，临床应用结果都说明其能提高患者的生活质量，未发现严重不良反应，安全性较好。流行病学研究发现，多种肿瘤情况的发生与p53基因的改变有着密切联系[6-7]，有将近60%的人类肿瘤的发生都与其改变有关，通过增强p53基因表达从而起到治疗肿瘤作用是目前药物作用的重要靶点之一[8]。据目前的研究发现，肾母细胞瘤也存在着p53基因缺失等基因突变的状况[9]。

p21是由p53调控的下游蛋白，p53-p21-去磷酸化细胞瘤通路也是调控肿瘤基因表达的重要通路之一，该通路的异常表达会导致机体细胞的癌变[10]。对于正常的细胞而言，该通路的激活会引起细胞的衰老和生长的抑制；而对于癌细胞而言，该通路的激活会诱导癌细胞的凋亡，从而起到治疗肿瘤的作用[11-12]。Bax是位于线粒体膜上的一类具有调控凋亡功能的蛋白，研究表明，只有当p53基因被激活时，Bax才会发挥促进细胞凋亡的作用[13]。rAd-p53注射液通过调控p21及Bax两个基因和蛋白的表达，从而起到促进癌细胞凋亡的作用。另外，研究还发现rAd-p53注射液诱导肾母细胞瘤细胞的凋亡，还与诱导细胞自噬的发生有关。研究表明，细胞自噬增加与细胞凋亡发生有着密切的关系[14]。本研究证实了rAd-p53注射液具有通过增加细胞自噬从而治疗肿瘤的作用，表明通过调节细胞自噬来抗肿瘤可能是p53治疗的新靶标。

本试验证实了rAd-p53注射液具有抑制肾母细胞瘤细胞增殖、抑制癌细胞周期、增强癌细胞凋亡、同时诱导p21和Bax基因表达而增强肿瘤细胞自噬的作用，具有治疗肾母细胞瘤的潜力，这对扩宽rAd-p53注射液的应用范围有着重要的意义。

图3 各组细胞中自噬体的透射电镜图（×10 000）Fig 3 Transmission electron microscopys of cell autophagosomes in each group（×10 000）

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Effects of rAd-p53 Injection on the Proliferation，Apoptosis and Autophagy of Nephroblastoma Cells

ZHONG Zhiyong，SHI Baojun，ZHOU Hui，WANG Wenbo（Dept.of Pediatric Surgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

OBJECTIVE：To study the effects of rAd-p53 injection on the proliferation，apoptosis and autophagy of nephroblastoma cells.METHODS：Nephroblastoma cells were respectively cultured 20 h with high，medium，low concentration（1×109，1× 108，1×107VP/mL）of Recombinant human rAd-p53 injection，cells with no injection were the blank control.Cell proliferation，cycle，apoptosis and related gene p21，Bax protein expressions were detected，and autophagy gene LC-3，Atg7，Atg12 expressions and number of autophagosomes were also detected.RESULTS：The proliferation inhibition rates of high，medium，low concentration of Recombinant human rAd-p53 injection to nephroblastoma cells were（42.86±3.18）%，（33.64±7.25）%，（16.26±9.07）%；apoptotic rates were（53.85±9.36）%，（37.35±9.64）%，（23.64±10.65）%，respectively.Compared with blank control，cells at period G0/G1were increased under high，medium，low concentration Recombinant human rAd-p53 injection，effects were relatively obvious under high，medium concentration（P＜0.05 or P＜0.01）；p21，Bax protein and LC-3，Atg7，Atg12 gene expressions were enhanced under high concentration，the number of autophagosomes was increased（P＜0.01）；Bax protein expression was enhanced under medium concentration（P＜0.05），the other indicators had no obvious changed（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Recombinant human rAd-p53 injection can inhibit the cell proliferation of nephroblastoma，and induce its apoptosis and autophagy.

Nephroblastoma；rAd-p53 injection；Cell cycle；Proliferation；Apoptosis；Autophagy

R361+.3

A

1001-0408（2017）07-0889-04

2016-07-21

2017-01-04）

（编辑：邹丽娟）

河北省2013年医学科学研究计划基金项目（No.20130151）

＊副教授，硕士。研究方向：儿童肿瘤。电话：0311-66002267。E-mail：zhongzy2005@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.07