银杏叶聚戊烯醇对Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤的保护作用研究Δ

陈卫卫，梁 迪，赵其秀，罗 毅，刘灵杰，莫丽萍，黄俊善，李海涛，3#（.广西中医药大学药学院，南宁53000；.南京中医药大学药学院，南京 003；3.江苏银杏研究院，江苏邳州 300）

银杏叶聚戊烯醇对Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤的保护作用研究Δ

陈卫卫1，2，3＊，梁 迪1，赵其秀2，罗 毅1，刘灵杰1，莫丽萍1，黄俊善1，李海涛2，3#（1.广西中医药大学药学院，南宁530001；2.南京中医药大学药学院，南京 210023；3.江苏银杏研究院，江苏邳州 221300）

目的：研究银杏叶聚戊烯醇（GP）对β淀粉样肽25-35（Aβ25-35）诱导dPC12细胞损伤的保护作用，为其用于阿尔茨海默病（AD）的治疗提供参考。方法：以神经生长因子（NGF）诱导PC12细胞分化为具有神经活性的dPC12细胞后，将dPC12细胞分为正常对照组（DMSO培养基）、Aβ25-35处理组（DMSO培养基）和GP试验组（分别含25、50、100、200、400µg/mL GP的DMSO培养基），培养24 h后，Aβ25-35处理组和GP试验组细胞均加入25 μmol/LAβ25-35诱导细胞损伤（即复制AD细胞模型），24 h后采用MTT法测定细胞存活率。另取细胞分为正常对照组（DMSO培养基）、Aβ25-35处理组（DMSO培养基）和GP试验组（分别含25、50、100、200 µg/mL GP的DMSO培养基），同法处理后检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平。结果：与Aβ25-35处理组比较，50、100、200、400µg/mL GP试验组dPC12细胞的存活率明显升高（P＜0.05或P＜0.01），100、200µg/mL GP试验组细胞培养液中LDH、ROS和MDA水平以及50µg/mL GP试验组细胞培养液中ROS水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈一定的浓度依赖性。结论：GP对Aβ25-35致dPC12损伤有一定的保护作用，为一种潜在的AD治疗药物。

银杏叶；聚戊烯醇；β淀粉样肽25-35；dPC12细胞；乳酸脱氢酶；活性氧；丙二醛

银杏叶为银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶，被收载于2015年版《中国药典》（一部）中，具有活血化瘀、通络止痛、化浊降脂等功效[1]，在临床使用较为广泛。迄今为止，已从银杏叶中发现了160多种化合物，主要包括黄酮、萜内酯、多糖、聚戊烯醇、挥发油及甾醇等。银杏叶聚戊烯醇（Polyprenols from the Ginkgo biloba leaves，GP）是银杏叶中一种具有显著生理活性的天然化合物，由15～21个异戊烯基单元构成，在银杏叶中的含量为1.0%～2.0%，高于银杏黄酮（0.8%～2.0%）和银杏萜内酯（0.2%～0.4%）[2-4]。研究表明，GP对高血压、糖尿病、慢性肝炎及肿瘤等具有明显改善作用，但关于其对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的研究尚未见报道。国外对针叶聚戊烯醇的研究较为多见，将其用于早、中期AD和其他脑疾病的治疗观察研究中发现聚戊烯醇能提高认知能力、改善脑损伤程度和影响酶活性，对于脑疾病有一定的疗效[5-8]。因此，本实验以GP为研究对象，以神经生长因子（NGF）诱导PC12细胞分化为具有神经活性的dPC12细胞后，通过体外β淀粉样肽25-35（Aβ25-35）诱导dPC12细胞损伤，制备体外AD细胞模型，探讨GP的神经保护作用，为GP在AD的治疗研究方面提供理论依据，并为神经保护药物的研发提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

RT-6000酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；FA2004电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；Sorvall ST16台式高性能离心机（美国Thermo公司）；IX51荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 提取物与试剂

GP（广西中医药大学药学院自制，批号：20150109，纯度：74.69%）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；马血清、双抗（青链霉素）购自杭州四季青有限公司；微量丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20150810）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号：20150615）均购自南京建成生物工程研究所；活性氧（ROS）检测试剂盒（批号：S0033）均购自碧云天生物技术研究院；Aβ25-35、NGF、二甲基亚砜（DMSO）、MTT均购自美国Sigma公司。

1.3 细胞株

鼠肾上腺嗜铬细胞瘤单克隆细胞系PC12细胞购自中国科学院上海生化与细胞所。

2 方法

2.1 GP的保存及Aβ25-35老化处理

取GP 40 mg，精密称定，溶于1 mL DMSO中，滤过除菌，分装，4℃条件下保存，备用。

[9-10]中方法，将1 mg Aβ25-35粉末溶于0.943 mL灭菌Mili-Q水中，制备成1 mmol/L的母液，振荡混匀，一次性无菌滤器过滤后于37℃环境中进行至少1周的老化，使其老化聚集产生神经毒性。将老化聚集的Aβ25-35溶液用1.5 mL EP管分装，－20℃冰箱中保存。试验前用所需培养液或细胞外液稀释至所需浓度。

2.2 PC12细胞培养

将PC12细胞培养于含6%马血清、6%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM完全培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。隔天换液、传代，取状态良好的处于对数生长期的细胞用于试验。

2.3 NGF诱导PC12细胞分化

将对数生长期的PC12细胞接种于事先经0.1%多聚赖氨酸包被的96孔板中，接种密度为1×103个/孔。培养24 h后，换成含NGF（50 ng/mL）的分化培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。隔天换液，连续诱导分化6 d，得到分化的PC12细胞（即dPC12细胞），在荧光倒置显微镜下观察细胞的生长状态。

2.4 Aβ25-35对dPC12细胞的损伤作用

将dPC12细胞接种于96孔板中，每孔加入不同量的Aβ25-35，作为终浓度分别为6.25、12.50、25、50µmol/L的Aβ25-35处理组，同时设置正常对照组（加等体积的DMSO完全培养基正常培养，不作其他处理），共5组。各组细胞数基本相同，每组设6个复孔。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，观察不同浓度Aβ25-35对dPC12细胞的损伤情况。每孔加入20µL MTT溶液（5 mg/mL），使MTT终质量浓度为0.5 mg/mL，37℃孵育4 h后终止培养。吸净上清，加入150µL DMSO，室温振荡10 min，使结晶物充分溶解，最后在酶标分析仪上测定570 nm波长处的光密度（OD）值。计算细胞的存活率（SR）[SR（%）＝（试验组OD值/正常对照组OD值）×100%]，以筛选最佳的损伤浓度。

2.5 GP对dPC12细胞存活率的影响

将dPC12细胞接种于96孔板中，每孔加入不同质量浓度的GP溶液，作为终质量浓度分别为25、50、100、200、400µg/mL的GP试验组，另设正常对照组（加等体积DMSO完全培养基常规培养，不作其他处理），共6组。各组细胞数基本相同，每组6个复孔。将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。根据“2.4”项下方法操作，考察细胞的存活率。

2.6 GP对Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤的保护作用

将dPC12细胞接种于96孔板中，试验共设置7组，分别为正常对照组（加等体积的DMSO完全培养基常规培养，不作其他处理）、Aβ25-35处理组（先用等体积DMSO完全培养基培养细胞24 h，再加入终浓度为25µmol/L的Aβ25-35溶液继续培养24 h）与GP试验组（先分别经25、50、100、200、400µg/mL GP药液预处理24 h，再加入终浓度为25µmol/L的Aβ25-35溶液继续培养24 h）。各组细胞数基本相同，每组6个复孔。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。根据“2.4”项下方法操作，考察细胞的存活率。

2.7 GP对Aβ25-35诱导损伤的dPC12细胞培养液中LDH、ROS和MDA水平的影响

将dPC12细胞接种于96孔板中，试验共设置5组，分别为正常对照组（加等体积的DMSO完全培养基常规培养，不作其他处理）、Aβ25-35处理组（先用等体积DMSO完全培养基培养细胞24 h，再加入终浓度为25µmol/L的Aβ25-35溶液继续培养24 h）与GP试验组（先分别经50、100、200µg/mL GP药液预处理24 h，再加入终浓度为25µmol/L的Aβ25-35溶液继续培养24 h）。各组细胞数基本相同，每组6个复孔。细胞培养24 h后，根据试剂盒说明书检测细胞培养培养液中LDH、ROS和MDA水平。

2.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。数据以±s表示，采用独立样本t检验进行组间的两两比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 NGF诱导PC12细胞分化结果

常规条件下PC12细胞的形态与嗜铬瘤细胞相似，呈圆形、短梭形或三角形，有的细胞两极有短突起；当用NGF处理后，可分化成类交感神经元样细胞，形成轴突样突起，细胞胞浆中还伸出多条其他突起，突起长短不一、数目不等，细胞之间相互连接交织成网，结果见图1。

图1 PC12细胞分化前、后的形态变化Fig 1 Morphological changes of PC12 cells before and after differentiation

3.2 Aβ25-35对dPC12细胞的损伤作用考察结果

与正常对照组比较（细胞存活率为100%），Aβ25-35处理组在浓度为6.25～50µmol/L时对dPC12细胞有明显损伤作用（P＜0.05或P＜0.01），且随着Aβ25-35浓度的增加细胞存活率也随之明显下降，呈现浓度依赖性。当Aβ25-35浓度为12.5µmol/L时，细胞的存活率为83.18%，表明其对dPC12细胞的活性产生了明显的抑制作用（P＜0.01）。Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的半数抑制浓度（IC50）约为25µmol/L，因此本研究选择25µmol/L Aβ25-35处理dPC12细胞以复制AD细胞模型。

3.3 GP对dPC12细胞存活率的影响考察结果

GP试验组的溶剂DMSO对dPC12细胞存活率基本无影响；不同质量浓度GP（25～400µg/mL）与dPC12细胞共孵育24 h后，各组细胞存活率分别为100%、97.43%、97.43%、105%、100%，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明GP在25～400µg/mL质量浓度范围时对dPC12细胞无毒性作用。

3.4 GP对Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤的保护作用考察结果

与正常对照组比较（细胞存活率为100%），Aβ25-35处理组细胞存活率（55.26%）显著降低（P＜0.01）。与Aβ25-35处理组比较，GP试验组用25µg/mL GP预处理后，细胞存活率（59.00%）无显著变化（P＞0.05）；用50～400µg/mL GP预处理后，细胞存活率（分别为68.18%、76.27%、88.63%、86.36%）均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。这提示GP可以减轻Aβ25-35诱导的神经细胞毒性，对dPC12细胞有一定保护作用。

3.5 GP对Aβ25-35诱导损伤dPC12细胞培养液中LDH、ROS、MDA水平的影响

与正常对照组比较，Aβ25-35处理组细胞培养液中LDH、ROS、MDA水平均显著升高（P＜0.01）；与Aβ25-35处理组比较，100、200µg/mL GP试验组细胞培养液中LDH、ROS、MDA水平以及50µg/mL GP试验组细胞培养液中ROS水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），呈一定的浓度依赖性。这提示GP可保护细胞膜的完整性，从而有效对抗Aβ25-35诱导的dPC12细胞损伤，结果见图2。

图2 各组细胞培养液中LDH、ROS和MDA水平测定结果Fig 2 Determination results of LDH，ROS and MDA levels in cell culture medium in each group

4 讨论

银杏叶提取物对脑局部缺血、癫痫发作、外周性神经炎具有神经保护作用，临床上用于治疗早期AD、血管性痴呆等疾病，但是银杏叶提取物化学成分复杂，其抗AD的物质基础未能阐明[11]。AD是老年人常见的神经退行性疾病，其发病可能与Aβ诱导的神经元凋亡密切相关。PC12细胞具有神经嵴源性和神经细胞特点，经NGF诱导后产生神经元样细胞，是目前比较公认的用来制作AD模型的细胞之一。Aβ是一种分子量为4.2 kD的多肽，含39～42个氨基酸，是许多正常细胞内的β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）的裂解产物。Aβ通常以Aβ1-40和Aβ1-42两种形式存在，其中Aβ1-42更易沉积，是老年斑的主要成分；Aβ25-35是Aβ生物活性片段，25-35位氨基酸序列呈β折叠是引起神经毒性必需的结构。研究表明，凝聚态Aβ25-35在体或离体条件下皆可表现出神经细胞毒性作用，诱导细胞凋亡，故Aβ25-35常被广泛应用于体内外AD模型制备的研究中[12-13]。在正常细胞中，LDH是主要存在细胞内的胞浆酶，细胞凋亡裂解时，LDH会释放到细胞外基质液中。因此，可以通过测定细胞培养液中LDH的含量来反映细胞损伤的程度[14]。机体受到毒性刺激时，细胞内ROS的产生与抗氧化防御之间失去平衡，导致ROS在体内蓄积，损伤细胞功能直至细胞死亡。MDA是神经元脂质过氧化物的产物，可结合蛋白质、磷脂等物质，使膜通透性增加，引起膜内外离子浓度失衡，造成细胞损伤。细胞培养液中ROS、MDA水平也可评价神经细胞损伤的程度。

本试验研究了GP对Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤的影响。结果显示，给予Aβ25-35处理dPC12细胞后，细胞存活率显著下降，细胞培养液中LDH、ROS、MDA水平也显著升高，这提示造模成功。用GP预处理dPC12细胞后，再用Aβ25-35诱导细胞损伤，结果与Aβ25-35处理组比较细胞存活率显著升高，细胞培养液中LDH、ROS、MDA水平明显降低，且呈一定的浓度依赖性，这提示GP具有拮抗Aβ25-35诱导dPC12细胞损伤的作用，可保护细胞膜完整性、减轻细胞损伤。GP作为一种潜在的抗AD药物，其作用机制值得进一步研究。

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Study on Protective Effects of the Polypentenol from Ginkgo biloba Leaf on Aβ25-35-induced Damage in dPC12 Cells

CHEN Weiwei1，2，3，LIANG Di1，ZHAO Qixiu2，LUO Yi1，LIU Lingjie1，MO Liping1，HUANG Junshan1，LI Haitao2，3（1.School of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China；2.School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；3.Jiangsu Institute of Ginkgo Biloba，Jiangsu Pizhou 221300，China）

OBJECTIVE：Study the protective effect of the polypentenol from Ginkgo biloba leaf（GP）on Aβ25-35-induced damage in dPC12 cells，and to provide reference for the treatment of Alzheimer’s disease（AD）.METHODS：After PC12 cells were differentiated into dPC12 cells with neural activity by incubating with never growth factor（NGF），the dPC12 cells were divided into normal control group（DMSO medium），Aβ25-35treatment group（DMSO medium）and GP test group（DMSO medium respectively containing 25，50，100，200，400µg/mL GP）.After 24 h cultivating，cells in Aβ25-35treatment group and GP test group were added 25 μmol/L Aβ25-35to induce cell damage（AD cell model），MTT method was used to determine the survival rate after 24 h.Other cells were divided into normal control group（DMSO medium），Aβ25-35treatment group（DMSO medium）and GP test group（DMSO medium respectively containing 25，50，100，200µg/mL GP），the lactate dehydrogenase（LDH），reactive oxygen species（ROS），malondialdehyde（MDA）levels in cell culture medium were detected after the same treatment.RESULTS：Compared with Aβ25-35treatment group，the survival rates of dPC12 cells in 50，100，200，400µg/mL GP test groups were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）；LDH，ROS，MDA levels in 100，200µg/mL GP test groups and ROS level in 50µg/mL GP test group were significantly reduced（P＜0.05 or P＜0.01），showing a certain concentration-dependence.CONCLUSIONS：GP has certain protective effect on Aβ25-35-induced damage in dPC12 cells，and it’s a potential drug for AD.

Ginkgo biloba leaf；Polypentenol；Aβ25-35；dPC12 cell；Lactate dehydrogenase；Reactive oxygen species；Malondialdehyde

R741.02

A

1001-0408（2017）07-0881-04

2016-08-17

2016-11-07）

（编辑：林 静）

广西自然科学基金面上项目（No.2013GXNSFAA-019115）；广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题（No.GZZY13-09）；壮瑶药协同创新中心课题（No.桂教科研﹝2013﹞20号）；广西壮瑶药重点实验室课题（No.桂科基字﹝2014﹞32号）

＊教授，博士研究生。研究方向：新药研发、药理学。E-mail：weiweichen2012@sina.com

#通信作者：教授，博士生导师，博士。研究方向：新药研发、药理学。E-mail：lihaitao0003@sina.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.05