活血消异方对子宫内膜异位症模型小鼠子宫内膜容受性的影响研究

吴天思 崔阳阳 孙伟伟 赵瑞华 徐彩

·论著·

活血消异方对子宫内膜异位症模型小鼠子宫内膜容受性的影响研究

吴天思 崔阳阳 孙伟伟 赵瑞华 徐彩

目的 探讨子宫内膜异位症对子宫内膜容受性的影响机制以及活血消异方对子宫内膜异位症模型小鼠子宫内膜容受性的作用。方法 通过“皮下+腹腔”同系异体子宫内膜注射的方法建立子宫内膜异位症妊娠功能低下小鼠模型，假手术予等量0.9%氯化钠溶液注射。建模成功后，随机分为中药组和模型组，中药组予活血消异方干预治疗，模型组和假手术组予等量0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)灌胃。连续治疗3个周期后，3组分别与不育雄鼠合笼，次日清晨8∶00观察阴栓，见栓者定为假孕第1天，于假孕第4天晚上10∶30取材，运用Western blot法检测小鼠子宫内膜整合素αvβ3和LIF的蛋白表达。结果 模型组小鼠种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3和LIF的蛋白表达量较假手术组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组小鼠种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3和LIF的蛋白表达量较模型组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但均低于假手术组(P<0.05)。结论 子宫内膜异位症对子宫内膜容受性存在不良影响。活血消异方能够显著提高小鼠围着床期子宫内膜着床因子整合素αvβ3和LIF的蛋白表达量，从而改善子宫内膜异位症模型小鼠子宫内膜容受性。

子宫内膜异位症；子宫内膜容受性；活血消异方；整合素αvβ3；LIF

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)简称内异症，是指活性的子宫内膜腺体和间质种植于子宫腔以外的部位浸润性生长，引起慢性盆腔痛、不孕、月经失调等一系列临床表现的一种雌激素依赖性疾病。内异症对妊娠各个环节如排卵、受精、着床等造成干扰，从而导致不孕[1]。其中，胚胎着床也被称为植入，是指胚泡通过定位、黏附种植于子宫内膜的过程，是妊娠的重要环节[2]。正常的子宫内膜只在一个短暂且关键的时期即“着床窗口期(implantation window)”允许胚泡着床[3]，子宫内膜容受性即是指子宫内膜在“着床窗口期”对胚泡植入时的接受能力。子宫内膜容受性的建立对胚胎的成功植入起到了决定性的作用[4]。近年来，越来越多的文献报道，内异症不孕患者着床窗口期在位内膜存在一系列超微结构、细胞形态、细胞因子和基因的异常改变，加之EM不孕患者行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的高移植率和低妊娠率，推测内异症可对子宫内膜容受性产生不良影响[5]。本研究在前期研究的基础上，通过建立子宫内膜异位症小鼠模型，探讨内异症对子宫内膜容受性的影响以及活血消异方对EM模型小鼠子宫内膜容受性的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康昆明雌性小鼠100只，7周龄，体重(25±3)g。昆明雄性小鼠30只，7周龄。由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，合格证号：SCXK(京)2014-0004。

1.2 药物及试剂 活血消异方由柴胡、制香附、丹参、赤芍药、莪术、皂刺等药物组成，由中国中医科学院广安门医院煎药室提供。以上生药加10倍量水，反复煎煮3次，每次1 h，合并煎液、过滤，放置24 h，浓缩。药物浓度为1.8 g生药/ml，药液4℃冰箱保存。Mouse整合素αvβ3抗体(NB600-1342，Novus Biologicals)，Rabbit LIF抗体(ab113262，Abcam)，Beta actin(TA-09，北京中杉金桥生物技术有限公司)。其他实验试剂及药物均由中国中医科学院广安门医院制剂室提供。

1.3 实验仪器 美国伯乐高压电泳仪，美国Thermo迷你振荡器，中国湘仪高速冷冻离心机，美国Fluka匀浆器。

1.4 实验方法

1.4.1 模型的建立及分组:造模前连续1周进行小鼠阴道脱落细胞涂片检查[1]，动情周期正常的小鼠作为受体小鼠。余作为供体小鼠，连续3 d皮下注射苯甲酸雌二醇0.02 mg(1 mg/ml)。造模时将供体小鼠常规消毒后脱颈处死，沿腹中线打开腹腔，将双侧子宫取出，置于盛有0.9%氯化钠溶液的培养皿中，然后采用“滚针法”将内膜挤压分离出，剪成1 mm×1 mm的碎片，待接种。用0.9%水合氯醛将供体小鼠腹腔注射麻醉，乙醇消毒后，将0.2 ml含4～8片1 mm3碎片的悬液，注射于小鼠的腹腔及皮下[7,8]。假手术组予同样方法注射等量0.9%氯化钠溶液。空白组不予任何处理。造完模后，连续5 d小鼠腹腔注射青霉素1万U。为促进内膜生长，以5 d为1个周期，连续3个周期注射0.02 ml(1 mg/ml)苯甲酸雌二醇于小鼠皮下。建模2周后，随机分为中药组和模型组。

1.4.2 给药方法:中药组予活血消异方，以15 μg·kg-1·d-1灌胃(每只小鼠每次灌胃量为(0.2 ml/10 g)，连续 3个周期(5 d为1周期)；模型组、假手术组依据体重予等量0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)灌胃。

1.5 采集标本 将3组雌鼠分别以2∶1与输精管结扎的不育雄鼠合笼，次日清晨8点观察阴栓，见阴栓者视为交配成功，即为假孕鼠，定为假孕第1天。将假孕第4天的假孕鼠于晚上10∶30脱颈处死，取出双侧子宫，放置在冻存管中，置于-80℃冰箱里保存，待检测。

1.6 Western blot法检测子宫内膜整合素αvβ3、LIF的蛋白表达量 将组织匀浆并提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量，配制浓度为12%分离胶和5%浓缩胶。根据24 μg/孔蛋白量进行上样，以SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转移到PVDF膜上。室温封闭2 h，分别加入1∶50稀释的整合素αvβ3一抗和1∶500稀释的LIF一抗，4℃过夜。次日洗膜后加入HRP标记的二抗，室温轻摇2 h，ECL试剂显影，用Labworks软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 整合素αvβ3表达情况 模型组种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3蛋白表达量较假手术组显著降低(P<0.01)；中药组种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3蛋白表达量较模型组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但低于假手术组(P<0.01)。见表1，图1、2。

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

图1 3组小鼠种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3蛋白电泳图

2.2LIF表达情况 模型组种植窗口期子宫内膜LIF的表达较假手术组显著降低(P<0.01)；中药组种植窗口期子宫内膜LIF蛋白表达量较模型组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但低于假手术组(P<0.01)。见图3、4，表2。

图2 3组小鼠种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3蛋白表达比较

图3 3组小鼠种植窗口期子宫内膜LIF蛋白电泳图

组别LIF/β⁃actin中药组 0．267±0．03∗#模型组 0．179±0．08∗假手术组0．380±0．07

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

子宫内膜容受性的形成机制极其复杂，受许多因素调控。一般而言，卵巢分泌的雌孕激素启动下游分子合成，在胚泡的影响下，子宫内膜局部的细胞因子、生长因子的自分泌、旁分泌机制启动充当中介因素，触发黏附分子的表达直接参与子宫内膜由非黏附状态到黏附状态的转变[9]。在着床窗口期，上述因子共同参与，相互作用，调节子宫内膜容受性的形成，使子宫内膜在形态结构和生理功能上发生一系列改变，以利于胚泡与子宫内膜的识别和成功植入。整合素是一类由α、β两亚单位构成的细胞表面粘附分子，有粘附和信号传递两大基本功能[10]。研究发现，种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3表达异常往往导致着床失败，且经治疗改善整合素αvβ3表达后可获得较好的妊娠结局[11]。因此，整合素αvβ3作为子宫内膜容受性建立的衡量标志已被国内外广大学者认可，其高表达对促进容受态子宫内膜的建立具有重要作用。本研究结果发现，子宫内膜内异症模型小鼠种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3的表达较假手术组显著降低(P<0.01)，提示子宫内膜异位症可导致整合素αvβ3在着床窗口期子宫内膜的异常表达，进而影响子宫内膜容受性和胚胎着床。着床窗口期LIF在子宫内膜的表达是判断内膜对胚泡是否具有容受性或胚泡能否着床的重要标志之一[12]。研究发现，LIF在不明原因所致不孕的患者着床窗口期子宫内膜表达较正常女性显著下

图4 3组小鼠种植窗口期子宫内膜LIF蛋白表达比较

降，表明LIF表达减弱或缺失可能是导致子宫内膜容受性下降胚胎着床失败的原因之一[13,14]。本研究结果显示，子宫内膜内异症模型小鼠种植窗口期子宫内膜LIF的表达较假手术组显著降低(P<0.01)，提示子宫内膜异位症可能通过影响着床窗口期LIF在子宫内膜的正常表达，从而降低了子宫内膜对胚泡的容受性。

中医认为瘀血阻滞是子宫内膜异位症的根本病机，病位主要在胞宫和冲任，瘀血是产生内异症一系列临床证候的关键因素[15]，故活血化瘀是内异症的主要治疗原则。前期研究结果显示，活血消异方不仅可以缩小病灶，缓解疼痛，预防内异症保守术后复发，对合并不孕的患者也有明显的助孕作用。活血消异方主要由柴胡、制香附、丹参、赤芍药、莪术、皂角刺等药味组成，具有疏肝理气，活血化瘀，通络散结的功效。方中柴胡、香附疏肝行气解郁。丹参、赤芍活血祛瘀，调经止痛。莪术、皂角刺破血行气，消癥止痛。观全方通过活血化瘀，调畅气机，达到化瘀消癥，行滞止痛，通络助孕的功效。本研究中，经活血消异方干预的中药组小鼠种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3和LIF的表达较模型组均显著升高(P<0.05)，提示活血消异方可以显著提高种植窗口期子宫内膜整合素αvβ3和LIF的活性表达，从而提高子宫内膜对胚泡的接受能力，这可能是活血消异方改善子宫内膜容受性的可能机制之一。

本研究可以看出子宫内膜异位症对子宫内膜容受性存在不良影响，子宫内膜异位症可能通过降低着床相关因子整合素αvβ3和LIF在着床窗口期子宫内膜的表达降低子宫内膜对胚胎的容受性。活血消异方可以上调整合素αvβ3和LIF在着床窗口期的表达，纠正子宫内膜异位症对子宫内膜的不良影响，改善子宫内膜容受性。但是由于子宫内膜容受性的建立过程非常复杂，涉及到众多细胞因子和基因的共同参与调控，本研究仅选取了整合素αvβ3和LIF两方面进行了初步研究，未能对更多的调控因子加以研究以相互印证，有待在以后的研究中进一步完善。

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3 李靖,谈勇.中西医对子宫内膜容受性研究进展.山东中医药大学学报,2014,38：288-293.

4 张平贵，冯云.子宫内膜容受性标志物的研究进展.上海交通大学学报(医学版),2012，32：1014-1019.

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Effects of Huoxuexiaoyi recipe on endometrial receptivity in mice models with endometriosis

WUTiansi,CUIYangyang,SUNWeiwei,etal.

DepartmentofGynecology,Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChieseMedicalSciences,Beijing100053,China

Objective To investigate the effects of Huoxuexiaoyi recipe on endometrial receptivity in mice models with endometriosis,and to explore its action mechanism.Methods The animal models with endometriosis pregnancy hypofunction were established in mice through the method of abdominal cavity+subcutaneous injections, and the mice in sham-operation group were injected with same volume of 0.9% sodium chloride solution. After the success of modeling,the mice were randomly divided into traditional Chinese medicine group (TCM group) and model group.The mice in TCM group were treated by Huoxuexiaoyi recipe,however,the mice in model group and sham-operation group were given same volume of 0.5% CMC by gavage.After three menstrual cycles, the mice in the three groups were put in the cage with infertile male mice (2∶1), then the vaginal plug was observed at 8∶00 am in the next day (D1). The detection specimens were taken at 10∶30 pm on D4 after false pregnant,and the expression levels of endometrial integrin-αvβ3 and leukaemia inhibitory factor (LIF) were detected by Western Blot.Results The expression levels of endometrial integrin-αvβ3 and LIF at implantation window phase in model group were significantly decreased,as compared with those in sham-operation group (P<0.05).Howevertheexpressionlevelsofendometrialintegrin-αvβ3andLIFatimplantationwindowphaseinTCMgroupweresignificantlyincreased,ascomparedwiththoseinmodelgroup(P<0.05),butwhichweresignificantlylowerthanthoseinsham-operationgroup(P<0.05).Conclusion The endometriosis has adverse effects on endometrial receptivity. Huoxuexiaoyi recipe can significantly increase the expression levels of endometrial integrin αvβ3 and LIF at implantation window phase so as to improve endometrial receptivity in mice with endometriosis.

endometriosis; endometrium receptivity;Huoxuexiaoyi recipe;integrinαvβ3;leukaemia inhibitory factor

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.001

项目来源：国家自然科学基金(编号：81173297)

100053 北京市,中国中医科学院广安门医院妇科(吴天思、崔阳阳、孙伟伟、赵瑞华);北京中医药大学(徐彩)

赵瑞华，100053 北京市,中国中医科学院广安门医院妇科；

E-mail:rhzh801@sohu.com

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A

1002-7386(2017)07-0965-04

2016-08-27)