CyclinD1及CDK4在软骨肉瘤诊断中的应用

王克猛 魏世平 牛长磊 王海燕 牛军强 孟庆聚

·论著·

CyclinD1及CDK4在软骨肉瘤诊断中的应用

王克猛 魏世平 牛长磊 王海燕 牛军强 孟庆聚

目的 观察CyclinD1及CDK4蛋白在软骨肉瘤中的阳性表达状态，探讨CyclinD1及CDK4蛋白在软骨肉瘤发生发展中的机制。方法 以SP法检测肿瘤组织中CyclinD1及CDK4蛋白表达的情况。结果 软骨肉瘤组织中CyclinD1、CDK4同时高表达，两者呈正相关关系(P<0.05)。结论CyclinD1及CDK4蛋白均呈高表达，在软骨肉瘤的发生发展中起互相协同，使肿瘤细胞的生长优势增强，对肿瘤的发生发展中发挥重要作用。

软骨肉瘤；CyclinD1蛋白；CDK4蛋白；免疫组织化学

软骨肉瘤(chondrosarcoma，CHS)起源于软骨组织的恶性肿瘤，Evans[1]根据软骨肉瘤的恶性程度分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。软骨肉瘤的治疗一般是手术局部或广泛切除，使用放疗、化疗等辅助治疗手段，效果不明显，手术切除容易发生复发及转移，预后往往很差[2]。本研究通过免疫组织化学Sp法研究软骨肉瘤中CyclinD1及CDK4的表达情况，探讨其在软骨肉瘤中表达的临床意义,进一步研究不同分化程度的软骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移之间的变化规律，以期为软骨肉瘤的分子靶向诊断提供新的标记物。

1 材料与方法

1.1 材料 随机选取河北省医科大学第三医院病理科、邢台医专第一附属医院病理科2008年3月至2011年10月手术切除的存档病例，经病理诊断，明确为软骨肉瘤。复习原切片及免疫组织化学资料，根据2002年WHO软组织与骨肿瘤病理学和遗传学分类标准[3]，经两位资深骨病理医师阅片确定，筛选出普通型软骨肉瘤46例，其中组织学分级Ⅰ级16例、Ⅱ级20例、Ⅲ级10例；患者年龄5～83岁，中位年龄43.7岁；男25例，女21例；发生部位：股骨27例，髋骨(髂骨、耻骨、坐骨)11例，其他部位8例。患者均为散发病例，且为初次手术，术前均未经放疗或化疗。作为对照另外选取18例骨软骨瘤及10例正常软骨组织。

1.2 方法 所有标本均连续切4 μm厚切片，贴于防脱玻片，用Sp法进行免疫组织化学法染色。鼠抗人CyclinD1单克隆抗体、鼠抗人CDK4单克隆抗体试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司，免疫组织化学染色按试剂盒操作说明进行，染色过程中设阳性和阴性对照，阳性对照用已知阳性切片，阴性对照采用PBS代替一抗。

1.3 免疫组化染色结果判断标准 CyclinD1、CDK4蛋白阳性表达为棕褐色颗粒，主要表达于细胞核内，分布呈现局灶性或弥漫性。显微镜下400×高倍镜下随机观察10个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，观察中向同一方向移动切片，保证观察切片不重复，不重叠。标本无阳性反应细胞或阳性反应细胞率小于10%为阴性；标本阳性细胞呈淡棕黄色或阳性反应细胞率介于10%～50%为阳性(+)；标本阳性细胞呈深棕黄色，且阳性反应细胞率大于50%为强阳性(++)[4]。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CyclinD1蛋白在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达情况CyclinD1蛋白阳性表现为细胞核内有棕黄色颗粒。10例正常软骨组织中呈弱阳性1例，阴性9例；在5例骨软骨瘤及28例软骨肉瘤中CyclinD1呈阳性表达，阳性率分别为27.8%(5/18)、60.9%(28/46)。在骨软骨瘤及软骨肉瘤中CyclinD1的阳性表达率明显高于正常软骨组织(P<0.05)，而骨软骨瘤中CyclinD1的阳性表达率明显低于软骨肉瘤(P<0.05)。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同组织学分级的软骨肉瘤中呈阳性表达分别有6、13及9例，阳性率分别为37.5%(6/16)、65%(13/20)和90%(9/10)，阳性表达率与分化程度呈反比(P<0.05)。见图1,表1、2。

IHC×400IHC×100

图1 CyclinD1在骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达HE

表2 CyclinD1在不同分化程度的软骨肉瘤中的表达 例

2.2CDK4在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达情况CDK4蛋白阳性表现为细胞核内有棕黄

色颗粒。在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中CDK4阳性表达率分别为20%(2/10)、38.9%(7/18)、63%(29/46)。在骨软骨瘤及软骨肉瘤中的阳性表达率明显高于正常软骨组织(P<0.05)，而软骨肉瘤中的阳性表达率明显高于骨软骨瘤(P<0.05)。CDK4蛋白的阳性表达率在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三级中分别为31.3%(5/16)、75%(15/20)和90%(9/10)，阳性表达率与分化程度呈反比(P<0.05)。见图2,表3、4。

IHC×400IHC×100

图2 CDK4在正常软骨组织及软骨肉瘤中的表达HE

表4 CDK4在不同分化程度的软骨肉瘤中的表达 例

2.3CyclinD1与CDK4蛋白的相关性及与软骨肉瘤主要临床病理资料间关系CyclinD1及CDK4同时高表达，两者呈正相关关系(P<0.05)，CyclinD1及CDK4的表达与患者的年龄、性别、肿瘤发生部位及大小差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5、6。

表5 CyclinD1和 CDK4的相关性分析 例

表6 CyclinD1、CDK4的表达与临床病理特征的关系 例

3 讨论

细胞周期素(Cyclins)-细胞周期素依赖性激酶(Cyclindependentkinases,CDKs)-细胞周期素依赖性激酶抑制因子(Cyclindependentkinaseinhibitors,CKIs)是调控正常哺乳动物细胞周期的网络。处于调控中心位置是CDKs，起正调节的是周期素，起负调节作用的是CKIs。在细胞周期中，G1/S期调控点；S期调控点；G2期调控点和中/后期调控点都是非常关键的过渡点。尤其G1/S调控点，可以调控细胞周期的时间。细胞周期中的许多因子参与肿瘤细胞的恶性转化过程中，特别是Gl期相关的各种因子，可单独或协同促进或抑制恶性肿瘤细胞的发生和发展。

1991年，Motkura等[5]发现了CyclinD1基因，该基因定位于11ql3染色体，其主要功能是与CDK结合并激活之，作为G1期细胞周期素，促使细胞由G1期进入S期。CyclinD1作为蛋白激酶复合体的调节亚基，使损伤的DNA得不到修复。其过度表达可使细胞增殖异常而导致肿瘤形成，因而被认为原癌基因。

CDKs家族是细胞周期调节机制的中心，可以被细胞周期蛋白(Cyclin)作为正性调节因子激活，也可以被细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKI)抑制，CDKs、Cyclin、CDKI这三种分子的表达和相互作用很大程度上决定了细胞周期的进展程度，主要在G1→S和G2→M两个转折点进行自控性调节，而CDKs的活性表达及调控是这种转变控制装置的核心。在哺乳动物中已发现的CDKs至少达7种，分别命名为CDC2 (CDK1)、CDK2～7，CDK4蛋白是CDKs蛋白家族中的重要成员，作为细胞周期G1期的调控因子，在细胞恶性转化的过程中起着至关重要的作用[6,7]，对于细胞的增殖和分化[8]的调节起重要作用。CyclinD1的基因扩增或蛋白过度表达在乳腺癌、卵巢癌、甲状旁腺癌、胃肠癌、食管癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、口腔癌、肝细胞癌、骨肉瘤等多种人类肿瘤组织中均有报道[9-12]。CDK4蛋白在鼻咽癌、胃癌细胞、脑星形胶质细胞瘤中有明显扩增或异常表达[13,14]，同时司晓辉等[4]也指出颌骨软骨肉瘤的发生发展与CDK4的过表达相关。

本实验中，在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中CyclinD1蛋白的阳性表达率逐步提高，阳性率分别为10%(1/10)、27.8%(5/18)、60.9%(28/46)，软骨肉瘤与骨软骨瘤阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，而且CyclinD1蛋白在软骨肉瘤中的表达随分化程度的降低其阳性表达明显增高(P<0.05)。CDK4在软骨肉瘤中的阳性表达率明显高于骨软骨瘤(P<0.05)，而且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同组织学分级中的软骨肉瘤中阳性表达率分别为31.3%(5/16)、75%(15/20)和90%(9/10)，随分化程度降低而逐渐增高，其阳性表达与组织学分级密切相关(P<0.05)。

综上所述，当细胞受到外源性增殖分裂信号刺激后，细胞周期因子CyclinD1基因表达增加，CyclinD1蛋白与CDK4蛋白结合、活化，形成以CDK4为催化亚基、CyclinD1为调节亚基的激酶复合体，促使细胞从G1期进入S期，至此细胞的分裂增殖得以完成，这可能是软骨肉瘤发生、发展的重要因素，是肿瘤细胞增殖的重要机制，可作软骨肉瘤诊断的分子生物学标志之一，为制订正确合理的治疗方案提供依据，那么我们通过使用CyclinD1及CDK4抑制剂，达到阻止癌细胞增殖的目的，从而为软骨肉瘤的分子靶向治疗提供依据。

1EvansHL,AyalaAG,RomsdahlMM.Prognosticfactorsinchondrosareomaofbone:aclinicopathologicanalysiswithemphasisonhistologicgrading.Cancer,1977,40:818-831.

2Artavanis-TsakonasS,MatsunoK,FortiniME.Notchsignaling.Science,1995,268:225-232.

3LeethanakulC,PatelV,GillespieJ,etal.Distinctpatternofexpressionofdifferentiationandgrowth-relatedgenesinsquamouscellcarcinomasoftheheadandneckrevealedbytheuseoflasercapturemicrodissectionandcDNAarrays.Oncogene,2000,19:3220-3224.

4 司晓辉,金岩,杨连君.细胞周期素依赖激酶4在颌骨软骨肉瘤的表达及意义.第四军医大学学报,2000,21:929-931.

5MotkuraT,BloomT,KimHG,etal.Anovelcyelinencodedbyabell-linkedcandidateoncogene.Nature,1991,350:512.

6MalumbresM,BarbacidM.Cellcycle,CDKsandcanaer:achangingparadigm.NatRevCancer,2009,9:153-166.

7PatelP,AsbachB,ShteynE,etal.Brk/Proteintyrosinekinase6phosphorylatesp27KIPI,regulatingtheactivityofCyclinD-Cyclin-dependentkinase4.MolCellBiol,2015,35:1506-1522.

8DicksonMA.Molecularpathways:CDK4inhibitorsforcancertherapy.ClinCancerRes,2014,20:3379-3383.

9UmekitaY,OhiY,SagaraY,etal.OverexpressionofcyclinD1predictsforpoorprognosisinestrogenreceptor-negativebreastcancerpatients.IntJCancer,2002,8:415-418.

10DworakowskaD,JassemE,JassemJ,etal.PrognosticvalueofcyclinD1overexpressionincorrelationwithpRbandp53statusinnon-smallcelllungcancer(NSCLC).JCancerResClinOncol,2005,31:479-485.

11JooM,KangYK,KimMR,etal.cyclinD1overexpressioninhepatocellularcarcinoma.Liver,2001,21:89-95.

12SiX.Expressionandsignificanceofcellcycle-relatedproteinscyclinD1,CDK4,p27,E2F-1andets-1inchondrosarcomaofthejaws.OralOncol,2001,37:431-436.

13 于洪泉,赵刚,许侃,等.脑星形细胞瘤中CDK4蛋白表达及意义.中国实验诊断学,2003,7:529-530.

14 赵英芳,田新霞,卢阳.胃癌中p16INK4a-CDK4-pRb通路蛋白表达异常.内蒙古医学院学报,2005,27:271-274.

Expression and clinical significance of CyclinD1 and CDK4 in chondrosarcoma

WANGKemeng*,WEIShiping,NIUChanglei*,etal.

*DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXingtaiMedicalCollege,Hebei,Xingtai054000,China

Objective To observe the expression of CyclinD1 and CDK4 proteins in chondrosarcoma,and to explore their action mechanism in pathogebesis and development of chondrosarcoma.Methods The expression levels of CyclinD1 and CDK4 protein were detected by immunohistochemistry (SP).Results The high-expression of CyclinD1 and CDK4 was found in chondrosarcoma tissues,moreover, the expression levels of CyclinD1 were positively correlated to those of CDK4 (P<0.05).Conclusion The high-expressin of CyclinD1 and CDK4 exists in chondrosarcoma tissues,which plays an important role in pathogenesis and development of chondrosarcoma.

chondrosarcoma; cyclinD1 protein; CDK4 protein; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.006

054000 河北省邢台市，邢台医学高等专科学校第一附属医院骨科(王克猛、牛长磊、王海燕、牛军强、孟庆聚)；邢台医学高等专科学校(魏世平)

魏世平,054000 河北省邢台市，邢台医学高等专科学校;

E-mail：weishiping2003@163.com

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A

1002-7386(2017)07-0985-03

2016-07-20)