HBV DNA整合与乙型肝炎、PHC关系的研究进展

吴殿磊,徐光华,刘娜(1西藏民族大学附属医院,陕西咸阳7108；延安大学附属医院)



HBV DNA整合与乙型肝炎、PHC关系的研究进展

吴殿磊1,2,徐光华2,刘娜2
(1西藏民族大学附属医院,陕西咸阳712082；2延安大学附属医院)

乙型肝炎病毒(HBV)是导致慢性肝炎的主要病因,同时亦是原发性肝细胞癌(PHC)的主要危险因素之一，研究证实HBV可通过整合自身基因进入到宿主基因组中或通过其结构蛋白、分泌蛋白,或通过表观遗传导致宿主基因突变,突变主要包括肝细胞部分DNA缺失和染色体重排等。HBV DNA整合对病毒本身和宿主肝细胞可产生影响，系列研究表明,乙型肝炎慢性化和PHC的发生发展与HBV DNA选择性整合可能存在关联,与乙型肝炎慢性化和PHC相关联整合位点的鉴定,将为乙型肝炎慢性化机制研究提供新的思路和线索,对未来临床基因诊断和治疗CHB及PHC有指导意义。

乙型肝炎；原发性肝细胞癌；乙型肝炎病毒DNA;整合位点鉴定

HBV是迄今发现最小的不完全环状嗜肝DNA病毒，HBV感染可致急慢性乙肝，亦是诱发原发性肝细胞癌(PHC)的重要危险因素之一。HBV DNA可通过整合进入到宿主基因组中或通过其编码的结构蛋白、分泌蛋白,或通过表观遗传导致宿主基因突变和染色体重排[1],突变主要包括病毒基因、宿主基因和染色体的变化，HBV DNA整合对病毒本身和宿主肝细胞可产生影响，部分突变与乙肝慢性化和终末期肝病(肝硬化、PHC)有关。现就HBV DNA整合与慢性乙肝、隐匿性HBV感染(OHBI)、PHC的关系综述如下，以期为乙肝慢性化机制研究及PHC基因诊断和治疗提供新的思路和线索。

1 HBV DNA整合概述

虽然HBV是DNA病毒，但因其在复制过程中存在独特的前基因组反转录过程，所以其基因组有机会整合至人基因组中。与逆转录病毒的感染不同,HBV DNA整合不是病毒复制所必须,所以HBV基因整合在其自然史中并非常规事件[2,3]。1980年首次在乙肝相关性肝细胞癌中检测到HBV DNA整合[4]，以后相继在急、慢性乙肝、肝癌组织中检测到多种不同形式的HBV DNA整合[3,5～8]。HBV基因整合至宿主基因组中有利于其持久感染,长期的慢性炎症可致肝细胞生命周期改变和增殖,这就增加了宿主基因组DNA终端的数量,从而有利于HBV DNA整合到宿主基因组中,这一过程拓扑异构酶I是关键性因子[9，10]。宿主基因组最常见的改变是倒立重复和缺失[4]。研究表明,HBV基因整合方式分为起始于顺向重复序列(DR)1，DR1向负链3'端延伸；起始于DR1向负链5'端延伸；起始于DR2向负链3'端延伸；起始于DR2向负链5'端延伸[2,11]。

慢性炎症或病毒重叠感染可使肝细胞暴露于氧化应激或诱变环境,丧失DNA修复能力,这可能是HBV DNA能整合至宿主基因组的重要原因[9]。HBV整合可诱导宿主基因组相应位置重排或部分缺失[12]。近期研究表明HBV DNA整合并非完全随机,存在优先选择性。基因转位、融合、缺失和广泛的基因组不稳定性可能是HBV DNA整合的原因,整合后宿主基因组的改变有机会产生选择性肝细胞克隆,HBV从而获益[4]。HBV基因整合一方面有利于其生存,另一方面可致宿主基因组某些位点突变,部分突变与乙肝慢性化有关,亦与PHC的发生发展相关。

2 HBV DNA整合与肝细胞癌变的关系

HBV感染是PHC的重要危险因素之一，文献报道，80%以上的肝癌组织中可检测到HBV DNA整合[13,14]。肝癌发生可能是HBV整合的结果[15],HBV整合可致肝细胞凋亡和抗癌基因信号通路异常[4]。研究[12]发现，应用逆转录PCR、Alu PCR和限制性核酸酶切位点PCR技术,HBV感染者甚至急性自限性乙肝患者HBV DNA能插入到机体基因组中。在85%～90%与HBV感染相关性PHC患者中能检测到整合的HBV DNA[9]。

据报道大部分整合发生在常见的基因脆弱部位附近或其中,如易于被删除、断裂、重排和扩增的基因[4],控制基因增殖、细胞信号级联转导的序列变异或不稳定Alu序列和微卫星序列变化可致癌基因的发生发展。整合到基因组中编码区或基因调节区的HBV DNA可改变宿主基因的表达或改变该基因所表达蛋白质结构和功能,这有可能导致恶变[9]。整合的HBV DNA表达合成成熟的preS/S和X蛋白触发级联信号转导亦可使肝细胞发生恶变[9]。HBV基因组的增强子原件能按照一定方向或与位置无关的方式激活异源性启动子,HBV基因增强子能反式激活距离整合处100 kb的宿主细胞基因[4]。

PHC患者HBV DNA整合靶基因区在早期研究中未明确，最近10年才有部分研究关注在PHC中HBV DNA整合位点和插入性突变。Paterlini-Bréchot等[5]采用HBV-Alu PCR技术从肝细胞癌患者标本中分离出9个HBV DNA整合区,这表明病毒导致的突变与PHC有关。位于HBV DNA整合区不同的基因具有特定关键性功能,这些功能与细胞信号级联转导或许有关。另外他们发现HBV DNA整合的靶基因：hTERT和IP3R基因在2例患者肿瘤组织中均出现,尤其人端粒酶逆转录酶基因[5]。Kimbi等[16]扩增5例急性乙肝患者和1例爆发性肝炎患者血HBV DNA和宿主基因组相应染色体DNA。在1例急性乙肝患者中,HBV DNA整合到宿主染色体7q11.23的位置,这是威廉姆斯-博伊伦综合征关键区域1基因所在位置,这个基因包含大量Alu重复序列、重复原件,这些位点是HBV DNA容易插入和重组的位点，且整合子在威廉姆斯-博伊伦综合征患者通常被删除基因序列的区域内,引起杂合性缺失。该研究组亦提到整合子克隆扩增与肿瘤形成有关,而早期HBV DNA整合可能诱发肝癌发生。

3 HBV DNA整合与慢性乙肝的关系

Murakami 等[6]以Alu-PCR法分别检测了19例急性乙肝患者、12例HBV相关慢性活动性肝炎患者、19例急性乙肝患者中3例肝脏标本中发现HBV DNA整合、全部12例HBV相关慢性活动性肝炎患者肝脏标本中均发现存在病毒整合，表明慢性乙肝HBV DNA整合率显著高于急性乙肝，推测乙肝慢性化与HBV DNA整合有关。Shi等[17]报道HBV DNA特定位点整合可致T细胞缺陷，而乙肝慢性化与T细胞缺陷有关。

Minami等[18]研究慢性HBV感染HBV DNA在肝细胞的整合,在6例患者肝脏组织中他们检测到42个独立的HBV DNA和肝细胞基因的结合部位,其中20个完成染色体定位。表明HBV DNA与宿主基因的每个整合,受到宿主6个基因克隆体中1个的影响。在这6个基因中,AXIN 1 (Axis)是抑制肝癌的基因;EYA3 、bobby sox和odd Oz 2基因对于器官的生长发育有重要作用,但他们的功能尚未明确。该研究提示HBV DNA优先整合到3号染色体。混合系白血病(MLL)2和4基因亦被认为是HBV DNA优先整合的靶基因[19,20]。MLL4基因位于19号染色体19q13.1,该处基因在实体瘤中研究显示存在扩增和重排。整合后特定位点表达的HBV X (HBx)或MLL4转录初级产物和蛋白与肝癌的发生有关[20]。乙肝慢性化与HBV DNA整合及优先的选择性整合可能存在关联。

早期，人们主要应用印记杂交、克隆测序和各种PCR的方法[20]来确定HBV整合。如今已开发应用新一代高通量测序(NGS)技术来鉴定HBV DNA特定的整合位点[21]。NGS亦称深度测序,与第一代Sanger测序法相比，NGS 技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点。NGS技术已大规模用于转录组测序、染色体免疫共沉淀测序、基因组甲基化测序、宏基因组测序、基因组从头测序和全基因组的重新测序等方面。目前，主要的高通量测序平台较多，以Hiseq和Miseq应用最为广泛。

考虑到全基因组测序费用过高,Ding等[22]开发了另外一种可选的方法,用于鉴定HBV DNA整合位点,这一价廉而有效的方法称为MAPS法[22]。通过这种方法,除了两个熟悉的FN1和TERT1靶基因,他们还鉴定出2个新的HBV DNA整合位点基因,即肌动蛋白调节4和SMAD5基因。他们发现HBV DNA优先选择17号染色体,且更多地整合到人基因转录位点。

4 HBV DNA整合与OHBI的关系

OHBI可检测到HBV DNA,但血清中HBsAg等检测不到。HBV DNA整合与OHBI关系尚不清楚，Bhargava等[23]研究发现，OHBI可致外周血淋巴细胞损害,OHBI与氧化应激有关。Pollicino等[24]报道了1例43岁PLC患者血清HBV和HCV检测阴性,但HBV-Alu PCR显示存在HBV DNA整合体,这个整合体位于PARD6G 基因上游,该基因在肝肿瘤组织中过表达。这两项研究表明OHBI导致基因表达异常可能与癌基因致癌途径有关。

HBV DNA有效整合到宿主基因组可增加OHBI几率，同时亦增加了癌变机会。最常见的HBV整合位点发生在MLL和hTERT基因,另外,60S核糖体蛋白基因、血小板衍生的生长因子受体基因和钙信号相关基因突变亦可能与癌变有关[3]。

综上所述，我们可通过PCR、基因测序、基因克隆、芯片和免疫组化等方法来研究HBV DNA对宿主基因组的影响,主要包括与乙肝慢性化和PHC发生发展有关的研究。初步的研究表明乙肝慢性化与HBV DNA整合及优先的选择性整合可能有关，但有待进一步研究证实。由HBV DNA整合引起的宿主基因突变鉴定及如何致PHC成为最近该领域的研究热点。机体癌基因产生和激活是多因素共同作用的结果，其中HBV DNA整合到宿主基因组是直接机制之一,其他还可通过其结构蛋白、分泌蛋白,或通过表观遗传致宿主基因突变,部分突变与PHC的发生发展有关。但这些因素致癌机制及各因素之间的关系有待进一步研究。

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国家自然科学基金资助项目(81560102)。

徐光华(E-mail:wdianlei@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.037

R512.6；R735.7

A

1002-266X(2017)25-0107-03

2017-02-15)