新型基因编辑技术在生物制药领域的应用与发展

陈远

（上海药明生物技术有限公司，上海 200131）

新型基因编辑技术在生物制药领域的应用与发展

陈远

（上海药明生物技术有限公司，上海 200131）

随着科学技术的不断发展进步，新型的基因编辑技术不断涌现，其中，锌指核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶以及CRISPR/Cas RNA引导核酸酶等基因组编辑技术在生物制药领域得到广泛应用。此类技术编辑效率高，在建立细胞模型新药开发，新型动物模型开发建立，细胞工程改造以及蛋白产物糖基化水平优化等方面应用广泛。本文主要介绍了三种新的基因编辑技术以及其在生物制药方面的应用发展。

基因编辑；生物制药；锌指核酸酶；转录激活子样效应因子核酸酶；CRISPR/Cas RNA引导核酸酶

随着科学技术的不断发展进步，新型的基因编辑技术不断涌现。新出现的基因编辑工具让研究人员能够几乎实现任何物种精确的修饰，并且可以达到核苷酸水平的精确度，还有着令人瞩目的速度[1]。为了达到定点改造基因的目的，通过基因编辑技术人工构建一个核酸内切酶，使它能在预定的基因组位置使DNA发生双链断裂，DNA的修复系统产生突变，使断裂的DNA得以修复。DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂[2]，一种是非同源末端连接（Nonhomologous end joining,NHEJ）另一种是同源重组（Homologous recombination,HR）[3]。通过这两种修复途径，基因编辑技术可以实现基因敲除、特异突变引入、定点转入基因等目的。随着锌指核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶和规律成簇间隔短回文重复序列RNA引导核酸酶系列新型基因编辑工具的出现，任意目的基因的敲除、外源基因的敲入、基因的修复和替换都能具有更高的效率和更快的速度[4]。

1 新型基因编辑技术的作用原理及分子机制

1.1 细胞天然修复机制同源重组和非同源末端连接

同源重组是指发生在同一染色体或非姐妹染色单体（sister chromatin）之间，含有同源序列的DNA分子内或分子之间的重新组合。如果将同源DNA片段导入受体细胞，这段DNA片段将可基于同源重组的原理替换目的基因片段，最终可达到敲除目的基因片段的目的。基因敲除除了用正常基因敲除对应的突变基因，也可以用突变基因或其他基因敲除相应的正常基因。

另一种特殊的DNA双链断裂修复机制是非同源末端连接。非同源末端连接可以在真核生物细胞的整个细胞周期中发生，其修复不需要提供模板，相当于将DNA断端彼此强制连接在一起。同源重组与非同源末端连接是两种有所不同但又相互补充的修复DNA双链断裂的手段。NHEJ不需要重组，断端之间的具有严格的DNA之间的同源性。如果存在一个外源性供体基因序列的情况，该序列会被NHEJ机制引入DNA双链发生断裂的位点，从而能够实现基因的定点敲入。

1.2 不同基因编辑技术的作用机制及其特点

1.2.1 人工锌指核酸酶（ZFNs）

人工锌指核酸酶（zinc-finger nucleases,ZFNs）是由Fok I核酸内切酶结构域和锌指蛋白结构域人工融合而成。其中，锌指蛋白能够识别并结合特异的DNA序列，Fok I则可通过二聚化产生核酸内切酶活性，在该序列附近造成DNA的双链断裂[5]。

锌指（Zinc finger,ZF）是构成ZFP结构域的基本单元，它是一种广泛存在于多种蛋白质中的蛋白基序（Motif），能够介导蛋白质与核酸、小分子或其他蛋白质的特异相互作用。多个可特异识别DNA并结合DNA的锌指串联后，构成ZFP。通过将ZFP与不同的功能结构域融合，建出不同用途的人工蛋白分子，如锌指激活因子（Zinc finger activator,ZFA）、锌指抑制因子（Zinc finger repressor,ZFR）、锌指核酸甲基化酶（Zinc finger methylase,ZFM）以及现在应用最为广泛的锌指核酸酶等，以实现对基因组的各种定点修饰或调控[6]。

Fok I核酸内切酶结构域来源于一种IIS 型限制性内切酶。原始类型的Fok I能够特异性识别双链DNA上的靶位点，并在靶位点下游非特异性地切割DNA双链。Fok I核酸内切酶结构域同ZFP的C端融合后构成ZFN单体。若在同一个双链DNA序列位点处两个ZFN单体特异结合，并且这两个位点在DNA双链上的距离和方向符合一定的要求时，两个Fok I结构域可形成二聚体的活性形式，在两个结合位点的间隔区（Spacer，通常为5～7bp）中发生切割，产生DSB切口。

1.2.2 转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）

TAL效应子是一种植物细菌分泌的天然蛋白，它可以特异性识别DNA碱基对。将其附加一个可靶向修饰DNA序列的核酸酶就生成了TALENs。应用设计后的TAL效应子可识别和结合全部的目的DNA序列，TALENs可与DNA结合并在特异位点切割DNA链，从而导入新的遗传物质。相比于传统的锌指核酸酶（ZFNs）技术，TALENs具有独特的优势，它的设计更简单，特异性也更高。但缺点是具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司完成模块筛选[7-8]。

1.2.3 规律成簇间隔短回文重复RNA引导核酸酶（CRISPR/Cas）

CRISPR/Cas系统是一种由Cas蛋白与成簇规律间隔的短回文重复序列组成的获得性免疫系统，它最初产生的原因是为了抵御外源性DNA的入侵。CRISPR/Cas系统作为一种功能强大的基因编辑工具，实验人员只需针对目的DNA序列设计大约20bp的RNA序列，并将其与核酸内切酶结构Cas结合，之后形成的RNA蛋白质复合物，即可靶定目的序列并对其进行剪切[9]。

由于CRISPR/Cas系统能对目的DNA进行高效定点编辑，并且实验操作简单易行、费用低廉，它被迅速转化成一种广受欢迎的最新型基因编辑技术。不同于ZFNs和TALENs复杂的蛋白质识别结构域，CRISPR/Cas的识别组件是RNA序列，由于RNA与DNA的识别更加直接，不会有锌指阵列那样的互相影响，可以大大简化筛选过程[10]。

2 新型基因编辑技术在生物制药领域的应用

2.1 建立筛选细胞模型及新药开发

动物生理、病理模型是药物筛选和靶点研究的重要手段。人功干细胞技术可与新型基因编辑技术相结合，建立符合人类特征的各种细胞模型，为新药研发奠定基础。现今已有文献报道了利用TALENs敲除编码周脂蛋白的PLIN1基因，建立游离脂肪酸的释放和甘油三酯储存的相关模型，以及为建立脂肪代谢和胰岛素抵抗的相关模型，可利用锌指核酸酶敲除编码RAC-b丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的AKT2。还比如相比较传统的RNA干扰敲除人肝癌HuH-7细胞系APOB基因的细胞模型，利用TALENs敲除APOB基因后建立的丙型肝炎病毒侵染模型具有更彻底的载脂蛋白B表达缺失[11]。

2.2 建立新型动物模型

在开发建立不同种类的动物模型上，不断有具较高实用性和良好性状的新兴品种涌现。例如，将猪的部分基因通过基因编辑技术替换成为人类对应基因，这种“人源化”基因编辑猪将为人类的医学实验、器官移植等提供重要支撑[12]。

2.3 细胞工程优化改造

利用CRISPR/Cas靶向野生型CHO细胞的GS和DHFR基因，可同时敲除GS和DHFR基因，获得GS和DHFR双缺陷型宿主细胞，即可同时用GS、DHFR两种筛选系统进行筛选，达到筛选出更优工程细胞的目的[13]。

2.4 蛋白产物的糖基化水平优化

利用ZFNs敲除工程细胞株乙酰氨基葡萄糖转移酶，可使其表达的蛋白分子呈高甘露糖糖型。在针对部分罕见病的酶替代疗法中，治疗性酶的甘露糖糖基暴露在糖链外端，可提高该酶与巨噬细胞内甘露糖受体的结合效率，从而提高酶替代疗法的疗效。此外，高甘露糖化的抗体在血液循环中的清除速率提高，在抗体介导的酶催化前药治疗策略中，可以降低血液循环中药物被催化产生毒性的概率。

3 新型基因编辑技术存在的问题及未来发展

随着对新型基因编辑技术的研究不断深入，靶定目标基因的特异性在不同的基因编辑工具中存在差异性，细胞内的脱靶效应（off-target effect）很大程度上由于基因编辑引起的。脱靶效应会造成严重的细胞毒性作用。脱靶效应发生时，非目的基因可能出现断裂，导致其在非目的区域出现基因插入、删除，可能直接导致细胞癌变甚至死亡。FokⅠ活性结构域一般为ZFNs和TALENs的酶切结构，只有在其成二聚体的状态下才具备使DNA双链断裂的活性，但由于其二聚化存在一定随机性，可能会激发随机DSB。可以通过对FokⅠ结构优化设计，使其自身二聚化处于非稳定状态，必须借助上下游才能实现稳定二聚体，从而降低脱靶效应[14]。

基因编辑技术可以通过编辑修改控制抗体分子中糖基化水平的各种基因，达到调控糖蛋白分子糖链功能的目的。同时也可以根据生物制药行业发展的不同需求为现有生物药物的优化改造提供更多路径。另外利用新型基因编辑技术对生产重组蛋白或单抗的宿主细胞进行工程改造，可显著提高细胞产量，延长细胞培养时间或细胞活率，相信会对生物制药的成本控制产业发展起到重要作用。新型基因编辑技术将在生物制药领域占据非常重要的地位，可以预见在不远的未来，科学家能够依据生物药行业内的需求，充分利用手中的基因编辑工具，为生物制药行业的发展进步作出贡献。

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Application and Development of Novel Gene Editing Technology in Biopharmaceutical Industry

Chen Yuan
（Shanghai Pharmaceutical Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai 200131）

With the continuous development of science and technology,new gene editing technology continue to emerge,the zinc finger nucleases,transcription activator like effector nuclease and CRISPR/Cas RNA nucleic acid enzyme genome editing technology is widely used in the field of biological pharmacy.These techniques have high efficiency in editing,establishing cell models,developing new drugs,establishing new animal models,improving cell engineering,and optimizing the level of glycosylation of protein products.Three new gene editing techniques and their applications in biopharmaceutical industry are introduced in this paper.

Gene editing;Biological Phamaceutics;Zinc finger nuclease;Transcription activator like effector nuclease;CRISPR/Cas RNA nuclease

Q789

A

2096-0387（2017）05-00111-04

陈远（1984—），女，四川成都人，本科，目前在职攻读上海交通大学工程硕士专业学位，副研究员，研究方向：生物工程。