升降散治疗血管性痴呆模型大鼠的疗效及作用机制

史江峰 马 健 郭春晖

(南京中医药大学基础医学院，江苏 南京 210023)

升降散治疗血管性痴呆模型大鼠的疗效及作用机制

史江峰1马 健 郭春晖1

(南京中医药大学基础医学院，江苏 南京 210023)

目的 探讨升降散治疗血管性痴呆模型大鼠的临床效果及作用机制。方法 SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和升降散组，假手术组大鼠仅切开颈前，模型组和升降散组大鼠行2-AO法永久性结扎双侧颈总动脉得到血管性痴呆模型大鼠。应用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力，免疫荧光组织化学染色检测血管内皮生长因子(VEGF)阳性细胞数和计数微血管密度(MVD)，细胞凋亡检测采用TUNEL法，采用SABC免疫组织化学法检测Bcl-2，Bax蛋白阳性表达。结果 给药后，升降散组和模型组大鼠的学习次数高于假手术组、正常组，正确次数均显著低于假手术组、正常组(P<0.05)，升降散组大鼠学习次数低于模型组，正确次数显著高于模型组(P<0.01)；正常组和假手术组大鼠仅有少量VEGF阳性细胞，升降散组阳性细胞数量最高，显著高于其他三组(P<0.01)；升降散组海马CA1区凋亡细胞数显著低于模型组而显著高于正常组和假手术组(P<0.01)；海马CA1区Bcl-2和Bax 阳性细胞数模型组大鼠高于正常组和假手术组(P<0.01)，升降散组大鼠海马CA1区Bax 阳性细胞数明显低于模型组而Bcl-2阳性细胞数明显高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 升降散可促进脑部血管再生，可通过下调Bax 蛋白和上调Bcl-2 蛋白表达以抑制脑细胞的凋亡，显著改善痴呆大鼠的学习、记忆能力。

升降散；血管性痴呆

血管性痴呆(VD)属于临床常见的疾病，指的是脑血管疾病造成的严重认知功能障碍的一组临床综合征，伴随着我国人口老龄化加剧，VD的发病率逐年上升，为仅次于阿尔茨海默病的老年性痴呆疾病，严重影响患者生活质量，目前缺乏理想的治疗药物〔1〕。本病主要是由于脑血管病变引发脑部缺氧、缺血造成记忆及认知等特定功能的神经组织功能障碍，由于缺血后再灌注极易致海马神经造成损伤并出现神经元死亡，进而诱发永久性脑损伤。中医理论认为，老年脏腑虚衰，肾精亏虚，脑髓不充，痰癖阻络，灵机不聪是痴呆的主要病因病机，但是中药在作用机制方面还有待进一步研究〔2〕。本研究探讨升降散治疗VD模型大鼠的效果和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取出生1 w的雄性健康SD大鼠72只，体重240～260 g，在有光环境和黑暗环境每12 h交替喂养，自由进食和饮水。

1.2 实验药物及仪器 药物为本院自制胶囊制剂升降散，由僵蚕、蝉蜕、姜黄、川大黄组成，制作成胶囊每粒重0.4 g。Morris 水迷宫由淮北正华生物仪器设备有限公司提供；Bcl-2，Bax 免疫组织化学试剂盒为武汉博士德生物工程公司生产，兔Ⅷ因子多克隆抗体购于北京中生公司；小鼠血管内皮生长因子(VFGF)单克隆抗体购于南京建成生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 造模和分组 全部SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和升降散组，每组均18只。模型组和升降散组大鼠适应性喂养7 d，术前12 h禁食、不禁水，麻醉使用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，将大鼠固定于鼠板上并碘酒消毒；以大鼠颈部中央处为切口点，双侧颈总动脉钝性分离，腹腔注射硝普钠2.5 mg/kg后立即夹闭10 min双侧颈总动脉，逐层缝合伤口后放回笼中继续饲养。假手术组大鼠行颈前切开而不阻断双侧颈总动脉、不注射硝普钠。大鼠喂养环境为 20℃左右，术后肌注青霉素2 000 U/d，连续 3 d。造模3 d，大鼠活动减少、行为迟缓、饮食下降代表建模成功，各组大鼠均随机选取12只作为研究。

1.3.2 给药方法 升降散组给予大鼠用生理盐水溶解的升降散，按10 ml/kg给药静脉滴注；其余三组均给予生理盐水10 ml/kg静脉滴注。

1.4 学习记忆能力测试 包括定位航行测试和空间搜索测试，前者为给药30 d后，水迷宫共分4个象限，大鼠朝池壁放入水中，随机选择方位作为起始位置，记录动物找到水下平台时间，每只大鼠每天共训练4次，每次需间隔0.5 h，联系训练5 d，第6天测定有效区停留时间、停留距离、逃避潜伏期及总路程等指标。定位航行能力测试后第2天开始空间搜索测试，平台去除，探查测试持续120 s，动物经先前象限的对侧入水，并记录大鼠途经有效区及虚拟平台的停留时间、距离、次数、有效停留时间距离和转向角等检测指标。

1.5 动物处死与标本收集 所有大鼠测试后称重，用 10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，将各组动物快速断头处死。标本收集在冰盘上快速剖取脑组织，吸取血迹，称量左侧皮层脑组织100 mg左右，加预冷的生理盐水制成10%的组织匀浆，4℃3 000 r/min，离心10 min，取上清液，储存-20℃冰箱备用。

1.6 免疫荧光组织化学染色 显微镜下观察VEGF阳性细胞数量，每只大鼠抽取随机切片2张，观察4个不重叠视野，计数4个视野下阳性细胞的总数，然后计算平均数。Ⅷ因子应用在微血管密度(MVD)计算方面，随机取大鼠切片2张，选择皮质区血管最丰富4处置于100倍镜下观察；微血管数量及计算每mm2内微血管量置于400倍镜下观察。

1.7 细胞凋亡和Bcl-2、Bax检测 采用免疫组化SABC方法检测，阳性标准：光镜下(1)出现棕黄色颗粒Bcl-2蛋白；(2)棕黄色颗粒Bax蛋白可见于胞质及核膜内；高倍镜下随机观察10个不重叠的胞质内皮质缺血区并计算出平均细胞阳性数。

1.8 统计学方法 应用SPSS16.0软件行SNK-q检验。

2 结 果

2.1 大鼠学习记忆功能检测结果 给药后，升降散组和模型组大鼠的学习次数高于假手术组、正常组，正确次数均低于假手术组、正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；而升降散组大鼠学习次数低于模型组、正确次数高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 VEGF阳性细胞检测结果 VEGF阳性细胞的胞膜或胞质为深棕黄色。见图1。正常组〔(54.78±3.53)个〕和假手术组〔(59.58±3.35)个〕大鼠仅有少量VEGF阳性细胞，阳性细胞数升降散组〔(82.89±3.25)个〕显著高于其他三组，模型组为〔(71.12±5.47)个〕(P<0.01)。

2.3 MVD检测结果 400倍光镜下观察，染色微血管形态无规则性，血管含有和不含有单层内皮细胞构成管腔血管比例相当，内皮细胞排列成条状或聚集成细胞团簇，或仅单个内皮细胞。见图2。MVD模型组〔(21.78±2.76)个/mm2〕与其他三组〔正常组(16.78±1.58)个/mm2，假手术组(18.80±1.69)个/mm2，升降散组(31.68±2.87)个/mm2〕比较差异有统计学意义(P<0.01)。

组别学习次数正确次数正常组31.17±3.127.85±0.81假手术组32.98±3.257.55±0.78模型组54.47±5.064.80±0.79升降散组40.12±3.856.21±0.88F/P值12.358/0.004213.054/0.0032

图1 各组VEGF阳性细胞(DAB，×400)

图2 各组Ⅷ因子标记阳性血管(DAB，×400)

2.4 海马CA1区细胞凋亡结果 给药后，大鼠海马CA1区凋亡细胞数升降散组为(18.28±4.43)个，显著高于正常组〔(2.64±1.37)个〕和假手术组〔(3.81±1.85)个〕，差异有统计学意义(P<0.05)，而显著低于模型组〔(28.89±5.58)个〕，差异有统计学意义(P<0.05)，(P<0.01)，见图3。

2.5 海马CA1区Bcl-2、Bax免疫组化结果 给药后，大鼠海马CA1区Bcl-2和Bax 阳性细胞数模型组均高于正常组和假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，升降散组大鼠海马CA1区Bax 阳性细胞表达数明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，而Bcl-2阳性细胞表达数明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2，图4。

图3 凋亡细胞染色结果(×400)

组别Bcl-2阳性细胞数Bax阳性细胞正常组3.12±1.353.23±0.75假手术组3.64±1.473.55±0.77模型组14.25±2.3135.18±1.56升降散组25.20±2.2117.58±1.34F/P值20.422/<0.000132.054/<0.0001

图4 Bcl-2、Bax免疫组化染色结果(DAB，×400)

3 讨 论

VD属于临床常见的老年慢性疾病，影响发病的因素较多，持续性高血压可损伤小动脉，增大血管阻力并减少血流量，造成心律失常而使血流量急剧降低，部分患者脂肪沉积在血管壁形成粥样硬化斑块也与VD发病相关。VD主要是由于脑血管病变引发脑组织缺氧、缺血而损伤脑部记忆、认知等特定神经组织所致〔3〕。患者出现脑缺血缺氧病理生理改变，缺氧状态下大脑皮质、海马、纹状体、苍白球等最容易受到损伤，脑缺血后使能量供应不足，细胞释放大量谷氨酸，细胞外液谷氨酸水平急剧升高，过度激活相应受体而使钙离子内流，诱发酶信号的级联反应，合成大量自由基而损伤细胞质、脂肪酸，而细胞去极化释放的钾离子可引发梗死处去极化，此外自由基还可激活炎症因子，加剧炎症反应并合成自由基从而进入恶性循环〔4〕。

中医学理论认为本病病位在脑和心，同肝脾肺肾脏腑功能失衡相关，脑为髓海，是元神之府，人至暮年，脏腑功能减退，肝肾亏虚，肾中精气不足，不能生髓，髓海空虚，进而神机失用形成呆证；另一方面部分患者平素忧思多虑，积怒伤肝，肝失疏泄，肝气郁滞，肝郁乘脾，脾失健运，痰浊内生，痰浊上扰蒙蔽清窍，思虑过度则耗上心脾，暗耗阴血，气血生化乏源，气血不足，不能充养脑髓，脑失所养，神机失用，造成神志失常，形成呆证，因此本病病位在心脑，病性属于本虚标实，因此在治疗上需要制定以调畅气机、补充血脉为原则的治疗方案〔5〕。

脑作为人体耗氧量最多的器官之一，其中不饱和脂肪酸含量丰富，一旦发生缺血缺氧就会产生大量的氧自由基，自由基化学性质活泼，能够直接攻击生物膜磷脂中不饱和脂肪酸，造成大脑神经细胞损伤继而让神经元丢失产生痴呆〔6〕。自由基介导的脂质过氧化反应在中枢神经病变中起到了重要作用，其引发损伤一直贯穿神经损伤进程，自由基最容易攻击脑细胞膜中多不饱和酸双键，还可以继续损伤蛋白与核酸，引发细胞进一步凋亡与蛋白质和DNA破坏。VD同梗死面积和低灌注具有很好的相关性，梗死灶的数量与范围是决定痴呆发生的重要因素。研究显示人体脑缺血和缺氧后，通过旁分泌机制促进了酪氨酸激酶受体-4和特异性酪氨酸激酶受体-1表达过程，诱导体内VEGF，激活细胞信号及转导机制，加快内皮细胞的增殖速率而形成新血管，并发挥加速神经干细胞增殖及保护神经元的作用，有效减少神经元缺损〔7〕。改善局部的微循环及促进血管再生对治疗VD具有重要意义，VEGF则在正调节因子中较为重要，特异性促进血管内皮细胞生长，起到了再生血管形成的启动效果〔8〕。

Ⅷ因子可以判断血管密度，进而判定脑组织中新生血管数量，同样可以体现对VD改善的效果。细胞凋亡是一个基因控制细胞死亡的过程，主要包括两方面：Bax为主导的促细胞凋亡；Bcl-2基因为主导的抗细胞凋亡。调控细胞凋亡的过程由两者表达水平决定，Bcl-2是内源性神经保护物质的一种，体内高Bcl-2可以阻滞多种凋亡因子，延长了细胞寿命，而过度Bax表达可通过形成同源二聚体而促进细胞凋亡〔9，10〕。

中药升降散方中僵蚕性温，归心、脾、肺、肝经，发挥清热解郁、祛风除湿、化痰散结的作用，药性轻浮上升，属于阳中之阳，引诸药上行，直达病所，《本草纲目》中记载：“治风化痰，散结行经，所谓因其气相感，而以意使之者也。盖厥阴、阳明之药，故又治诸血病、症病、拒病也”〔11〕；蝉蜕甘咸，其气清肃，升浮宣透，能够清热解毒宣毒透表；姜黄气味辛苦性寒，可以行气活血化瘀，畅通气机，活血通络，温散寒邪，助僵蚕和蝉蜕散郁火；大黄作为使药，苦寒泄泻，通腑化瘀，清热泻火，擅长降浊阴，攻积导滞，推陈出新，让体内血液通畅而气行；全方合用寒温并用，升降同施，具有升清降独、通里达表、宣郁散火、活血化癖、驱风胜湿、镇惊止痉的作用。

本研究显示，升降散应用在VD模型大鼠中能够改善学习记忆功能。升降散可能是通过促进缺血区血管生成、改善局部血液循环发挥作用。升降散可能通过下调Bax蛋白和上调Bcl-2蛋白的表达减少细胞凋亡，并对VD大鼠认知功能起到改善作用。

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5 王 茜，徐玉振，亓春花，等.血管性痴呆患者抗心磷脂抗体与颈动脉内膜厚度及颈动脉狭窄的相关性研究〔J〕.中华脑科疾病与康复杂志(电子版)，2015；5(2)：80-3.

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10 赵宝敏，张 楠，程 焱.盐酸美金刚对血管性痴呆大鼠 N-甲基-D天冬氨酸受体的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2015；17(3)：303-6.

11 戴 毅，吴玉泉，胡金华.帕金森病合并痴呆与血管性痴呆认知功能障碍及焦虑抑郁情绪的比较〔J〕.中华全科医学，2015；13(8)：1283-5.

〔2016-04-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

马 健(1959-)，男，博士，博士生导师，主要从事中医脑病基础及临床研究。

史江峰(1971-)，男，硕士，主任中医师，主要从事脑病中医基础及临床研究。

R749

A

1005-9202(2017)06-1341-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.016

1 徐州市中医院脑病科