发酵温度与pH两段式组合策略对α-溶血性链球菌生物量和甘露聚糖肽的影响

许翠 (广州万孚生物科技有限公司，广东 广州 510530)

杨晓茹，夏帆 (长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

徐洪宣，董平 (湖北欣恺生物科技有限公司，湖北 荆州 434020)

高梦祥 (长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

发酵温度与pH两段式组合策略对α-溶血性链球菌生物量和甘露聚糖肽的影响

许翠
(广州万孚生物科技有限公司，广东 广州 510530)

杨晓茹，夏帆
(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

徐洪宣，董平
(湖北欣恺生物科技有限公司，湖北 荆州 434020)

高梦祥
(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

温度和pH是影响微生物生长代谢的重要因素。以α-溶血性链球菌(α-hemolyticStreptococci)为发酵菌种，在5L发酵罐中，采用调整发酵温度与pH两段式组合策略，即0～8h控制pH 7.5，8h后将pH调至7.0；0～11h控制温度37℃，11h后将温度调至33℃，以探讨发酵温度与pH两段式组合策略对α-溶血性链球菌生长及甘露聚糖肽产量的影响。结果表明:采用这一策略，α-溶血性链球菌最大生物量为15.344g/L，比恒定发酵温度37℃和pH 7.5控制模式下提高了11.2%，比单独调控发酵温度条件下提高了33.8%；甘露聚糖肽的最大产量为1.305g/L，比发酵温度恒37℃和恒pH 7.5控制模式下提高了35.9%，比单独调控发酵温度条件下提高了17.2%。

α-溶血性链球菌(α-hemolyticStreptococci)；甘露聚糖肽；发酵温度；发酵pH；组合策略

发酵温度和pH是影响微生物繁殖和代谢最重要的2个因素，主要包括对其生物活性的影响、微生物细胞吸收营养物质能力的改变以及改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性[1]。不同微生物只能在一定的温度和pH范围内生长和代谢[2]。分阶段控制温度和pH能很好地增强微生物发酵效率，使目标代谢产物增加[1，2]。

α-溶血性链球菌(α-hemolyticStreptococcus)又称甲型溶血性链球菌，它一方面能导致人体引发多种疾病，而另一方面，它经深层发酵培养提炼精制可得到的一种具有多种生物活性的糖肽类物质——甘露聚糖肽。甘露聚糖肽是我国独立研制的具有自主知识产权的新型免疫增强剂[2，3]。临床证明，甘露聚糖肽作为治疗肿瘤的辅助药，能减轻放疗、化疗的毒副作用[4]，对再生障碍性贫血、血细胞减少症[5]、感染过敏性关节炎[6]、多种口腔粘膜病[7]等非肿瘤疾患均有较好的疗效；还可用于治疗各种肿瘤，与化疗、放疗联合治疗肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、乳腺癌、白血病等。同时，甘露聚糖肽还可以最大限度地激活畜禽机体免疫细胞和免疫器官，充分发挥机体免疫系统抗病机能，增强动物对各种环境的应激机能，在提高生产性能的同时，还可有效降低抗生素使用频率和剂量，减轻畜产品中兽药残留量，增强畜产食品安全性，对保证人类健康，环境保护和畜牧业可持续发展都具有重要的意义[8]。

然而，目前α-溶血性链球菌经深层发酵产生甘露聚糖肽的产率只有万分之六，提高产率成为该领域的当务之急。目前通过优化其培养基和发酵条件提高甘露聚糖肽产率的报道很有限[3，9]。利用发酵罐研究提高甘露聚糖肽产率的发酵组合控制策略鲜有报道。本研究在α-溶血性链球菌的发酵过程中，利用调控发酵温度和pH，研究了两阶段组合发酵策略对该菌生长及甘露聚糖肽产量的影响，旨在找到高产甘露聚糖肽的最优条件，为甘露聚糖肽的大量生产提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

菌种:α-溶血性链球菌由长江大学生命科学学院微生物实验室提供。

主要设备:Biotech-5BGG-7000A型自动发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司产品)；HVE-50型高压蒸汽灭菌器(华粤企业集团有限公司产品)；HFsafe-1200型生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司产品)；TE124S型电子分析天平、PB-10型酸度计(均为赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品)；HYC-360型医用冷藏箱(青岛海尔特种电器有限公司产品)；THZ-312型台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司产品)；UV-3300PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司产品)；TL-18M型台式告诉冷冻离心机(上海市离心机械研究所产品)。

无菌生理盐水:称取0.9g氯化钠溶解于100mL蒸馏水中，转入250mL的锥形瓶加塞封口后于立式压力蒸汽灭菌器中121℃灭菌25min。灭菌后低温保藏备用。

0.1mol/L的NaOH溶液:称取0.4gNaOH溶解于100mL蒸馏水中，封好瓶口，低温保藏备用。

试管液体培养基:葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，pH 7.2。每支试管装量l0mL，121℃灭菌25min。

摇瓶种子培养基:葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，牛肉膏0.5%，氯化钠1.0%，pH 7.5。每瓶装6mL，121℃灭菌25min。

发酵培养基:蛋白胨0.3%，酵母膏0.7%，牛肉膏1%，氯化钠0.5%，pH 7.2。121℃灭菌25min。

1.2 菌种预处理

菌种活化:将血平板中的菌种于超净工作台上接入试管液体培养基中，在37℃下培养18～24h，经无菌考查和形态学鉴定合格后再接入试管液体培养基中，37℃培养18～24h，反复2次。挑选生长旺盛、活力强、形态特征等符合要求的菌种，将其在2～4℃冰箱中保存。

摇瓶种子的制备:将试管液体菌种按0.2%的接种量在无菌条件下接入摇瓶培养基中，静置37℃，培养24h，备用。

1.3 试验方法

将长势良好、无杂菌的摇瓶种子液按1%的接种量接入发酵培养基中，通过控制温度、pH单因素变化及温度、pH两因素组合对菌种进行发酵培养。分别在发酵0、2、4、6、8、11、14、17、20、23、25、27、30、32h时测定生物量和代谢产物甘露聚糖肽的含量。

1)温度两阶段转换发酵 将摇瓶种子液按1%的接种量倒入发酵罐中进行发酵培养，控制温度为37℃，pH为7.5，无菌空气量以能翻动培养液为宜，转速为150r/min培养。在发酵11h时调节温度为33℃，pH保持7.5不变。

2)pH两阶段转换发酵 将摇瓶种子液按1%的接种量倒入发酵罐中进行发酵培养，控制温度为37℃，pH为7.5，无菌空气量以能翻动培养液为宜，转速为150r/min培养。在发酵8h时调节pH为7.0，温度保持37℃不变。

3)温度和pH两因素组合发酵 将摇瓶种子液按1%的接种量倒入发酵罐中进行发酵培养，控制温度为37℃，pH为7.5，无菌空气量以能翻动培养液为宜，转速为150r/min培养。在发酵8h时调节pH为7.0，温度37℃不变；发酵11h时调节温度为33℃，pH保持7.0不变。

4)恒温与恒pH发酵 将摇瓶种子液按1%的接种量倒入发酵罐中进行发酵培养，控制温度为37℃，pH为7.5，无菌空气量以能翻动培养液为宜，转速为150r/min培养。

1.4 试验指标的测定方法1.4.1 菌体生物量的测定

生物量采用菌体干重法测定量。将各组发酵液取出后，在80℃的水浴锅灭菌30min后，冷却至室温，并分装在无菌离心管中，在8000r/min的转速下离心15min，此为一次离心；再将上清液倒去，用蒸馏水洗涤沉淀2～3次，同样转速下经二次离心后，再次倒去上清液，洗涤后将沉淀即菌体放入105℃的烘箱中烘干至恒重，并用分析天平称重并记录数据，其与空管重量差值即为菌体干重。

1.4.2 甘露聚糖肽含量的测定

1)标准曲线的建立 精密称取经105℃恒重的D-甘露糖10mg，置100mL容量瓶中，加水使溶解至刻度，摇匀得100μg/mL标准溶液。再分别精确量取标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置试管中，用水稀释至2mL，各加3%苯酚溶液1.0mL，加入浓硫酸4.5mL，快速摇匀，待冷却至适温后在490nm波长处进行比色，测定其光密度，以光密度为横坐标、甘露糖浓度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。

2)发酵液中甘露聚糖肽含量的测定 精确量取20mL发酵液于离心管经离心机10000r/min、4℃离心10min，去除菌体留取上清液；上清液中加入3倍体积量的无水乙醇，充分搅拌静置后10000r/min、4℃离心10min，去除上清液即得到沉淀物；将所得沉淀物用10mL蒸馏水溶解，用15%的三氯乙酸调pH为1.5～3.5，充分搅拌静置后10000r/min、4℃离心10min，去除杂质即得到上清液；向去除杂质的上清液中缓慢加入40mL的无水乙醇，充分搅拌静置后10000r/min、4℃离心10min去除上清液即得到沉淀物；重复上述方法2次，得到的沉淀物为粗糖肽；将所得沉淀物用10mL蒸馏水充分搅拌溶解稀释。精确吸取不同时间离心后的糖液0.1mL，用无菌水稀释至2mL，以无菌水作对照，各加3%苯酚溶液1.0mL，加入浓硫酸4.5mL，快速摇匀，待冷却至适温后在490nm处进行比色，测定光密度，由回归方程计算甘露聚糖肽含量。

2 结果与分析

2.1 甘露聚糖肽标准曲线的确定

图1 甘露聚糖标准曲线

以甘露聚糖肽在490nm处的甘露聚糖浓度为横坐标，以光密度为纵坐标作图，得到线性回归方程:y=0.0794x+0.0026，R2=0.9998，表明其拟合效果很好，因此该标准曲线可用于甘露聚糖肽含量的确定。

2.2 两段式发酵温度与pH转换对生物量的影响

由图2可知，在发酵过程中转换pH，α-溶血性链球菌的生物量上升先变慢后加快，在发酵过程中转换温度对菌种生长有明显的抑制作用。两阶段pH转换，发酵8h将pH 7.5转换为7.0后，生物量在11h时开始加速增加，30h达到最大，为16.347g/L，至发酵结束仍无明显衰退现象。两阶段温度转换，发酵11h后，菌体的生长受到了抑制，生物量增加明显减缓，一直处于较低水平，为11.465g/L，比恒温与恒pH对照组的最大生物量13.805g/L降低了2.340g/L。而温度与pH两段式组合策略极大地促进了菌体的生长，发酵8h转换pH，生物量增加加快，在17h进入稳定期，在25h达到15.344g/L，比其他条件下的最大生物量平均多了1.472g/L，并且稳定期相比更长。可见，两阶段温度转换对α-溶血性链球菌的生长没有促进作用，两阶段pH转换和发酵8h转换pH、11h转换温度的组合策略才能明显地促进其生长。

图2 不同调控条件下的菌体生物量

图3 不同调控条件下的菌体比生长速率

图4 不同调控条件下的甘露聚糖肽比合成速率

2.3 两段式温度与pH转换对菌体比生长速率及甘露聚糖肽比合成速率的影响

图3和图4反映了通过对发酵过程中温度和pH进行不同调控策略，对α-溶血性链球菌的比生长速率及代谢产物甘露聚糖肽的比合成速率的影响。

从图3可以看出，在发酵过程的前8h，因发酵条件都是37℃和pH 7.5，所以前8h菌体的比生长速率的变化基本一致。8h后不同的转换条件对菌体比生长速率有不同的影响。两阶段pH转换和温度与pH两段式组合策略实验中，发酵8h将pH 7.5转换为7.0后，在8～20h菌体的比生长速率均高于其他条件下的。而两阶段温度转换试验中，发酵11h将温度37℃转换为33℃后，对菌体的比生长速率无明显影响，其与恒温与恒pH对照条件下的比生长速率无明显差异。所以，两阶段pH转换和温度与pH两段式组合策略可以促进发酵过程中甲型溶血性链球菌的比生长速率，而两阶段温度转换对菌体的比生长速率无明显影响。

从图4可以看出，在发酵过程的前8h，因发酵条件一样，都是37℃和pH 7.5，所以前8h比合成速率变化基本无差异。8h后，不同的转换条件对甘露聚糖肽的影响不同。两阶段pH转换实验中，8h时转换pH 7.5至7.0后，甘露聚糖肽的比合成速率与恒温与恒pH组无明显差异。两阶段温度转换实验中，甘露聚糖肽的比合成速率在8～17h均高于相同时间段的其他条件下的比合成速率，在发酵14h时达到最大值0.170h-1。温度与pH两段式组合策略实验中，甘露聚糖肽的比合成速率在发酵前期处于较低水平，在发酵中后期有所提高，在17～27h比合成速率维持在较高水平，20h时甘露聚糖肽的比合成速率为0.082h-1，其他条件下的同时段的甘露聚糖肽的比合成速率平均仅为0.034h-1。整体来说，两段式pH转换对甘露聚糖肽的比合成速率无明显影响，两段式温度转换在发酵中期会增加代谢产物甘露聚糖肽的比合成速率，温度与pH两段式组合策略在发酵后期能有效的提高代谢产物甘露聚糖肽的比合成速率。

2.4 两段式温度与pH转换对甘露聚糖肽产量的影响

发酵温度与pH单因素调整以及温度与pH组合转换策略对甘露聚糖肽产量的影响结果见图5。从图5可以看出，发酵8h转换pH和发酵11h单独转换温度甘露聚糖肽产量都有明显的增加。两阶段pH转换试验中，发酵8h将pH 7.5转换至7.0后，代谢产物甘露聚糖肽的产量增加加快，在8～25h维持在较高水平，到14h后产量增加减慢，25h达到最大合成量1.278g/L。两阶段温度转换实验中，发酵11h将温度37℃转换为33℃后，甘露聚糖肽的产量增加同样加快，在15～27h合成量处于较高水平，25h达到最大量1.114g/L。温度与pH两段式组合策略实验中，在8h转换pH，11h转换温度后，11～17h过程中没有明显变化，等到17h后，甘露聚糖肽产量增加速度不断加快，27h时达到最大值，为1.305g/L，分别比恒温与恒pH和两阶段温度转换条件下的甘露聚糖肽最大值分别增加了35.9%、17.2%，与两阶段pH转换条件没有统计差异。以上结果表明，单独调整温度或pH都可以有效地提高甘露聚糖肽的产生，而温度与pH的两段式组合策略能更大限度地提高甘露聚糖肽的产量。

图5 不同调控条件下的甘露聚糖肽合成量

3 结论

采用发酵8h将pH 7.5转换至7.0，11h将温度37℃转换为33℃的温度和pH两段式组合策略可以有效地促进α-溶血性链球菌的生长并提高其代谢产物甘露聚糖肽的产量。最大生物量比恒定发酵温度37℃和pH 7.5控制模式下提高了11.2%，比单独调控发酵温度条件下提高了33.8%；甘露聚糖肽的最大产量比发酵温度恒37℃和恒pH 7.5控制模式下提高了35.9%，比单独调控发酵温度条件下提高了17.2%。

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[编辑] 余文斌

2016-10-31

湖北省自然科学基金项目(2013CFB392)；湖北省重点产业创新团队项目。

许翠(1988-)，女，硕士，研究方向为微生物代谢及分子生物学。通信作者:高梦祥，mxgao0398@163.com。

Q939.97

A

1673-1409(2017)02-0046-06

[引著格式]许翠,杨晓茹，夏帆,等.发酵温度与pH两段式组合策略对α-溶血性链球菌生物量和甘露聚糖肽的影响[J].长江大学学报(自科版)，2017，14(2)：46～51.