沼泽红假单胞菌培养基的优化研究

幸晶晶，王瑞品，柳忠玉 (长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

马立安 (长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025；长江大学荆楚特色食品研发中心，湖北 荆州 434025)

沼泽红假单胞菌培养基的优化研究

幸晶晶，王瑞品，柳忠玉
(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

马立安
(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025；长江大学荆楚特色食品研发中心，湖北 荆州 434025)

为有效促进沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的生长和繁殖，采用单因素试验和正交试验对其培养基配方进行了优化，结果显示，最佳培养基组成配方为:乙酸钠3.8g/L，氯化铵1.3g/L，酵母膏0.7g/L，微量元素0.8 mL/L。在此条件下培养，沼泽红假单胞菌菌液D660nm值可达 2.186，比优化前提高了29.4%。

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)；培养基；优化

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)是一类具有原始光合体系、能在厌氧或兼性厌氧环境中进行光合作用不产氧气的原核生物总称。光合菌具有固碳、产氢、可氧化和分解硫化氢及多种毒物的能力[1～3]。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)是光合细菌的代表菌株之一。沼泽红假单胞菌作为养殖水质净化剂，早已广泛应用于水产养殖中，可有效降低对虾养殖废水中的化学需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)。沼泽红假单胞菌富含各种生物活性蛋白、泛酸、叶酸和多种维生素，可作为饲料添加剂用于经济动物的养殖[4～7]。沼泽红假单胞菌也能加速植物对养分的吸收和转化，有利于提高作物的产量和品质，同时又能够改善土壤菌群的分布，提高土壤的肥力[8,9]。但是，沼泽红假单胞菌培养基成分以及各种培养条件的研究仍然是制约该菌广泛应用的主要因素之一[10]。本研究旨在对沼泽红假单胞菌的培养基配方进行优化，简化生产配方，降低生产成本，以期为产业化生产沼泽红假单胞菌菌剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

沼泽红假单胞菌为长江大学生命科学学院微生物实验室保藏。

基础培养基成分：乙酸钠、氯化铵、酵母膏、微量元素(由FeCl3·6H2O 5mg、CuSO4·5H2O 0.05mg、H3BO41mg、MnCl2·4H2O 0.05mg、ZnSO4·7H2O 1mg、CO(NO3)2·6H2O 0.5mg溶于蒸馏水中，并定容至1000mL配制而成)、蒸馏水。

1.2 方法1.2.1 菌种的活化

将实验室保存的菌株在无杂菌的条件下转接 3 次，接种量10%，于 32℃、1500 lx 光照条件下培养 72h。

1.2.2 单因素试验

在基础培养基中添加4.2g/L乙酸钠、0.8g/L酵母膏、1mL/L微量元素，先改变氯化铵浓度(1.1、1.3、1.5g/L)，确定最优的氯化铵浓度；接着在最优的氯化铵浓度基础上改变酵母膏的浓度(0.5、0.6、0.7g/L)，确定最优的酵母膏浓度；再在优化的氯化铵、酵母膏浓度基础上改变微量元素的浓度(0.0、0.4、0.6、0.8、1.0mL/L)，确定最优的微量元素浓度；最后在优化的氯化铵、酵母膏、微量元素浓度基础上改变乙酸钠浓度(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5g/L)，确定最优的乙酸钠浓度。

1.2.3 正交试验

采用 L9 (34)正交试验设计，选择沼泽红假单胞菌培养基中上述4种成分作为试验的因素，每个因素选3个水平，分别进行试验组合。然后对这 9 种不同组合的培养基按 10%接种量分别接种沼泽红假单胞菌菌株，于 32℃、1500lx 光照条件下培养 72h，测定培养液的光密度D660nm值。

2 结果与分析

2.1 氯化铵对沼泽红假单胞菌生长的影响

注：不同字母表示组间显著性差异(P<0.05)，图2～4同。图1 不同浓度氯化铵下沼泽红假单胞菌的生长情况

图2 不同浓度酵母膏下沼泽红假单胞菌的生长情况

不同浓度氯化铵下的沼泽红假单胞菌培养液D660nm测定结果如图1 所示。由图1可见，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值随着氯化铵浓度的升高呈先上升后下降的趋势，但不同浓度氯化铵下的沼泽红假单胞菌生长没有显著影响(P> 0.05)，当氯化铵浓度为 1.3g/L 时，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值稍高，因此，后续试验中氯化铵的浓度采用1.3g/L。

2.2 酵母膏对沼泽红假单胞菌生长的影响

不同浓度酵母膏下的沼泽红假单胞菌培养液D660nm测定结果如图2 所示。由图2可见，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值随着酵母膏浓度的升高而上升，当酵母膏浓度为 0.7g/L时，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值最高，且显著高于其他浓度组 (P<0.05)。因此，后续试验中酵母膏的浓度采用0.7g/L。

2.3 微量元素对沼泽红假单胞菌生长的影响

不同浓度微量元素下的沼泽红假单胞菌培养液D660nm测定结果如图3 所示。由图3可见，在培养基中添加微量元素的条件下，沼泽红假单胞菌的D660nm值显著高于不加微量元素的对照组(P<0.05)，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值随着微量元素浓度的升高呈先上升后下降的趋势，当微量元素浓度为0.6mL/L 时，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值最高，因此，后续实验中微量元素的浓度采用0.6mL/L。

2.4 乙酸钠对沼泽红假单胞菌生长的影响

不同浓度乙酸钠下的沼泽红假单胞菌培养液D660nm测定结果如图4所示。由图4可见，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值随着乙酸钠浓度的升高呈先上升后下降的趋势。当乙酸钠浓度为4.0g/L时，沼泽红假单胞菌培养液的D660nm值最高，且显著高于其他浓度组(P<0.05)。

2.5 培养基配方优化的正交试验

采用L9(34)正交试验对培养基成分进行优化，对乙酸钠、氯化铵、酵母膏及微量元素进行4因素3水平的正交试验，考察培养基组分对沼泽红假单胞菌生长影响，选取最优的培养基配方。正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。由表2可得出，培养基成分对沼泽红假单胞菌生长的影响顺序为D>A>B>C，微量元素对沼泽红假单胞菌生长的影响最大，酵母膏对生长的影响最小。最终确定优化培养基的组分为A2B2C3D3，即乙酸钠3.8g/L、氯化铵1.3g/L、酵母膏0.7g/L、微量元素0.8mL/L。在此条件下培养，沼泽红假单胞菌D660nm值可达2.186，比优化前提高了29.4%。

图3 不同浓度微量元素下沼泽红假单胞菌的生长情况图4 不同浓度微量元素下沼泽红假单胞菌的生长情况

表1 因素水平表

表2 培养基优化正交试验结果

3 讨论与小结

近年研究发现，pH、温度、接种量、光照强度等因素影响沼泽红假单胞菌的生长，并且它们之间又相互影响[10～15]。本研究在自然pH、37℃培养箱条件下重点考察了培养基成分对沼泽红假单胞菌生长的影响。在沼泽红假单胞菌株培养基组成的优化试验中，对正交试验设计得到的9种配方组合分别进行了培养试验，其结果显示最优配方组合为:乙酸钠为3.8g/L，氯化铵1.3g/L，酵母膏0.7g/L，微量元素0.8mL/L。在此条件下培养，沼泽红假单胞菌培养液D660nm值可达2.186，比优化前提高了29.4%，说明该配方培养基可显著促进沼泽红假单胞菌的生长和繁殖。由于沼泽红假单胞菌在农作物、水产养殖业及污水净化方面应用效果较多。因此，对沼泽红假单胞菌培养的最优化培养基成分配搭和培养条件的研究，可为该类光合菌的规模培养和工业化生产提供依据。

[1]Zhu X,Xie X,Liao Q.Enhanced hydrogen production byRhodopseudomonaspalustrisCQK 01 with ultra-sonication pretreatment in batch culture[J].Bioresour Technol,2011,102:8696～8699.

[2]Scheuring S S,Rui P G,Valerie P.The Photosynthetic Apparatus ofRhodopseudomonaspalustris:Structures and Organization[J].J Mol Biol,2006,358:83～96.

[3]Carlozzi P,Pushparaj B,Degl A,etal.Growth characteristics ofRhodopseudomonaspalustriscultured outdoors,in an underwater tubular photobioreactor,and investigation on photosynthetic efficiency[J].Applied microbiology and biotechnology,2006,73:789～795.

[4]周茂洪.几株沼泽红假单胞菌的分离和分类特性研究[J].微生物学杂志,2001,21(3):20～23.

[5]黎建斌,何为,李大列,等.沼泽红假单胞菌对罗非鱼养殖水质及生长的影响[J].河北渔业,2013,(6):8～10.

[6]吴向华,杨启银,刘五星,等.沼泽红假单胞菌的营养成分与评价[J].江苏农业科学,2005,(1):86～87.

[7]杨莺莺,曹煜成,李卓佳,等.PS1 沼泽红假单胞菌对集约化对虾养殖废水的净化作用[J].中国微生态学杂志,2009 ,21 (1):4～6.

[8]魏克强,杨俊仙,魏治中.光合细菌改善新型烟草品质的初步研究[J].微生物学通报,2008,35(2):220～224.

[9]张信娣,曹慧,徐冬青,等.光合细菌和有机肥对土壤主要微生物类群和土壤酶活性的影响[J].土壤,2008,40(3):443～447.

[10]陈秀丽,陈有光,王育锋,等.光合细菌培养基配方的优化研究[J].渔业现代化,2007,34(6):47～48.

[11]刘德海,陈国参,解复红,等 .沼泽红假单胞菌发酵培养条件优化研究[J].饲料工业,2014,35 (16):43～47.

[12]杜冰,杨公明,刘长海,等 .沼泽红假单胞菌发酵培养研究 [J].饲料工业,2007,28 (24):38～40.

[13]夏冰冰,康建平,苏波,等 .沼泽红假单胞菌发酵条件的响应面优化研究 [J].食品与发酵科技,2010,46 (4):29～31.

[14]全亚玲,戴静,马力,等 .沼泽红假单胞菌培养基配方及培养条件优化试验研究 [J].西南民族大学学报,2012,38 (3):383～386.

[15]欧小兵,张小琴,李涵依,等.沼泽红假单胞菌优化培养及检测方法的研究[J].西南民族大学学报,2013,39(5):679～683.

[编辑] 余文斌

2016-10-14

幸晶晶(1993-)，女，硕士生，研究方向为食品微生物与生态学。通信作者：马立安，malian@yangtzeu.edu.cn;柳忠玉，179595859@qq.com。

Q935

A

1673-1409(2017)02-0042-04

[引著格式]幸晶晶，王瑞品，柳忠玉，等.沼泽红假单胞菌培养基的优化研究[J].长江大学学报(自科版)，2017，14(2)：42～45.