γ—分泌酶抑制剂对体外培养的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞Notch信号通路相关蛋白表达的影响

冯东凡+范东旭+金松+韩梅++杨婷+刘彦东++王凯峰++孙瑶

[摘要] 目的 探讨γ-分泌酶抑制剂（DAPT）对体外培养糖尿病（DM）大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）Notch信号通路相关蛋白表达的影响。 方法 体外培养DM大鼠VSMCs，随机分为两组：正常培养基组（con组）、加入不同浓度（0.15、2.50、7.50 μmol/L）DAPT的培养基组（实验组），72 h后收集细胞，分别用双向电泳方法和Western blot法检测Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的表达。 结果 ①双向电泳图谱证实提取的蛋白中含有目的蛋白。②Western blot检测结果显示：随DAPT浓度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白的表达均递减；7.50 μmol/L组与对con组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；0.15、1.25 μmol/L组与con组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L组与7.50 μmol/L组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.15 μmol/L组与1.25 μmol/L组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 DAPT作用于体外培养的DM大鼠VSMCs后，使其Notch信号通路相关蛋白表达减少，在一定浓度范围内（1.25～7.50 μmol/L）呈浓度依赖性。

[关键词] Notch信号通路；γ-分泌酶抑制剂；血管平滑肌细胞；双向电泳

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0024-04

糖尿病足（DF）是糖尿病（DM）的慢性并发症之一，是高血糖、周围血管病变、周围神经病变等多种因素共同所致，病因复杂，致残、致死率高，治疗费用高。目前针对DF及微血管病变的治疗效果难以令人满意。Notch信号通路具有促进非DM动物缺血区血管新生、动静脉分化等作用。本课题通过γ-分泌酶抑制剂（DAPT）干预体外培养的DM大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs），研究对Notch信号通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

冻存的DM大鼠VSMCs（SPF级SD大鼠购自大连医科大学动物实验中心，质量合格证号：0003546，经DM大鼠模型建立、取材后冻存）[1]。

1.2 主要试剂和仪器

DAPT（美国Sellect公司）；全自动凝胶电泳图像分析系统（日本Olympus公司）；Mini-Protean 3电泳系统、Mini Trans-Blot转移系统（北航图像中心）；蛋白浓度测定试剂、β-actin（美国Sigma公司）；兔抗Notch1单克隆抗体、兔抗Notch3单克隆抗体、兔抗Notch4单克隆抗体、仓鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）單克隆抗体、仓鼠抗大鼠Jagged-2蛋白（JAG2）单克隆抗体、仓鼠抗大鼠DLL4蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；Bio-Lyte载体两性电解质、IEF电泳槽、IPG预制胶条（美国BioRad公司）。

1.3 细胞培养

取冻存的DM大鼠VSMCs进行细胞复苏，将其接种于96孔板，D-Hank′s液冲洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02% EDTA·4Na约3 mL进行消化，制成单细胞悬液。按1∶2传代培养，传至3代后，随机分为两组：正常培养基（con）组和加入DAPT的培养基（实验）组（浓度梯度分别为0.15、1.25、7.50 μmol/L），继续培养传至6代。

1.4 方法

1.4.1 蛋白提取 取配置好的单细胞悬液，加入预冷的细胞裂解液400 mL，冰浴静置40 min，提取蛋白。

1.4.2 双向电泳检测目标蛋白 在198 mm×256 mm×1 mm SDS凝胶上，标记纵横坐标，将目的蛋白加入坐标原点，进行第一向等电聚焦电泳，聚焦结束后的胶条经平衡处理后立即进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取出凝胶，拍照，应用计算机软件分析处理。取提取的蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算上样量。煮沸，变性，标记，上样检测或于-80℃保存。

1.4.3 Western blot 检测蛋白表达情况 取30 μg蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4单克隆抗体（1∶200），4℃孵育过夜，加入二抗IgG（1∶5000稀释），室温孵育1 h，ECL试剂盒显影，以β-actin为内参进行数据标准化，以对照组为参照样本，计算Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双向电泳检测结果

DM大鼠VSMCs蛋白双向电泳检测结果显示，在凝胶上可以看到800多个蛋白点，其中大多数蛋白位于pH 5.0～8.5，分子量为134～300 kD。应用计算机软件Image-Master 2D Platinum software分析，其中“十字”表示计算机探测到的凝胶分离出的蛋白质点，“标签”表示经过计算机软件自动编号后的目标蛋白点，说明提取的蛋白质中含有实验所需目的蛋白。见图1。

2.2 Western blot检测结果

Western blot检测结果显示：随DAPT浓度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白表达水平递减；7.50 μmol/L组与con组相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01），0.15、1.25 μmol/L组与con组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L组与7.50 μmol/L组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.15 μmol/L组和1.25 μmol/L组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2～3。

3 讨论

DM已成为世界性疾病[2]，根据国际糖尿病联盟（IDF）发布的2015全球DM版图[3]，目前世界成年DM患者约4.15亿人，中国目前为1.096亿人，且处于不断增加中。据统计，15%～25%的DM患者一生中会发生DF[4]，而DM患者的截肢率与非DM患者相比要高40倍[5]，且截肢预后较差。据统计[6]截肢后5年死亡率达40%。

在DM血管病变过程中，VSMCs从中膜移行到内膜，增殖、分泌生长因子，参与纤维膜的形成，VSMCs还分泌合成许多基质分子参与血管病变的发生[7-8]。因此可见，VSMCs在DM血管病变的进展过程中发挥着重要作用。

目前针对DM血管病变的治疗主要以内科药物保守治疗、腔内介入手术[9]、旁路移植手术[10]为主，但效果均欠佳，近年来开展的细胞因子治疗[11]用于诱导和促进DM血管缺血区血管再生的探索取得一定效果，但也存在一定不足。因此，寻求新的方式以促进更多血管生成是非常有必要的。

有研究证实，Notch信号通路能促进非DM动脉缺血区的血管新生[12-14]，在血管发育的过程中发挥重要的作用。在Notch信号通路的受体和配体中，Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4在血管平滑肌细胞表达[15]。Notch1、Notch3、Notch4受体分别主要由Jagged-1、Jagged-2、DLL4配体启动[16-17]。Qiao等[18]、Zela等[19]证实Notch信号通路对体外培养正常大鼠血管VSMCs的增殖、分化、凋亡等具有重要的调控作用，进而促进血管新生。但是Notch信号通路是否对DM动脉缺血区具有相同的作用尚未清楚。DAPT是Notch信号通路的抑制剂，可特异性抑制γ-分泌酶活性，进而抑制Notch受体在S3位点的酶切，有效抑制Notch信号通路的激活[20]。

本课题组既往实验经流式细胞学检测证实，体外培养的DM大鼠VSMCs经DAPT作用72 h，对其细胞的抑制率较其余各时间段明显，且当DAPT浓度在0.25、1.25、7.50 μmol/L时，其半抑制率最为明显[1]，所以本实验选用以上3个浓度的DAPT作用72 h后行相关检查。实验结果显示：各实验组与con组提取Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白后行双向电泳及Western blot检测证实DAPT可以抑制Notch信号通路的活动，抑制Notch相关蛋白的表达。双向电泳图谱经计算机软件分析表明提取蛋白中含有目的蛋白。Western blot检查结果显示：随DAPT浓度的增加，各蛋白的表达均递减，说明DAPT干预Notch信号通路能抑制DM大鼠Notch信号通路相关蛋白的表达；其中，当DAPT浓度在7.50 μmol/L时，对Notch信号通路各蛋白表达的抑制作用最明显；当DAPT浓度在0.15～1.25 μmol/L之间时，干预Notch信号通路后对相关蛋白的抑制作用无明显差异；当DAPT浓度在1.25～7.50 μmol/L之间时，随着浓度的升高，DAPT对Notch信号通路的抑制作用逐渐增强，呈剂量依赖型。从结果中可看出，Nocth1、Nocth3、Nocth4蛋白分别与Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白降低的幅度相似，证实了Notch1、Notch3、Notch4受体分别主要由Jagged-1、 Jagged-2、DLL4配体启动这一理论。本实验结果提示：Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白在体外正常条件下培养的DM大鼠VSMCs中均有所表达；且DAPT能不同程度阻断DM大鼠VSMCs Notch信号通路的活性，抑制Notch信号通路相关蛋白的表达，且该抑制作用在一定浓度范围内（1.25～7.50 μmol/L）呈正相关。结合本课题前期实验证实DAPT干预Notch信号通路后可抑制DM大鼠VSMCs的增殖、促进凋亡等，提示Notch信号通路与DM大鼠VSMCs的增殖、凋亡等有关。此项研究提示，促进Notch信号通路的表达或许可以促进DM患者缺血区VSMCs的增殖，促进更多新生血管的再生，但目前对Notch信号通路在DM患者中的具体机制还存在许多亟需解决的问题。

总之，DAPT干预DM大鼠VSMCs后能抑制Notch信号通路相关蛋白的表达，抑制Notch信号通路的活性，证明Notch信号通路在DM大鼠血管再生中起着重要作用，而进一步研究Notch信号通路在DM大鼠中的作用機制或许为治疗DM患者缺血区血管新生提供一种新的可能。

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（收稿日期：2016-11-15 本文編辑：程 铭）