微囊藻受短时超声波胁迫蛋白表达差异研究

骆灵喜+李彬辉+林秋月+王波

摘要：为探索微囊藻抵抗短时超声波表达调控相关蛋白质，应用双向电泳技术对微囊藻短时超声波处理蛋白质表达进行分析，结果表明，71个蛋白质点上调，56个蛋白质点下调，54个新增蛋白质点，21个消失蛋白质点。对其中8个差异大的蛋白质点采用MALDA-TOF-MS进行质谱分析，并经数据库搜索匹配，鉴定出2个未知蛋白、6个功能蛋白。这些功能蛋白参与抗氧化和抗炎症、磷酸盐合成、电子传递等生理过程，实现微囊藻在短时超声波胁迫下的代谢平衡和自我保护。

关键词：微囊藻；短时超声波；蛋白表达；双向电泳

中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1366-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.043

Differentially Expressed Proteome of Microcystis under Short-time Ultrasound Stress

LUO Ling-xi1，2，LI Bin-hui1，2，LIN Qiu-yue1，2，WANG Bo1

（1.Peking University Shenzhen Research Institute，Shenzhen 510008， China；2.Shenzhen-Hongkong Institution of Industry，Education & Research Environmental Engineering Technique Co.，Ltd.，Shenzhen 510008， China）

Abstract：In order to explore the regulation mechanism for key protein expression， the Microcystis treated by short-time ultrasound were used to analyze the total protein based on 2DE. Results showed that 71 upregulated protein spots，56 downregulated protein spots，54 new adding protein spots and 21 protein spots disappeared under short-time ultrasound stress. Eight differential proteins were chosen for further MALDI-TOFTOF/MS analysis， the results showed that 2 unknown proteins and 6 functional proteins were detected. These proteins were relevant to some physiology procedures，such as antioxidant，anti-inflammatory，synthesis of phosphate and electron transfer，which were beneficial for the metabolism balance and self-protection under short-time ultrasound stress.

Key words：microcystis；short-time ultrasound；protein-expression；two-dimensional electrophoresis

近年來，随着水体富营养化现象的日趋严重，对于饮用水源较为单一且紧缺的城市饮用水生产影响很大，首先，高藻源水会堵塞滤池，增加反冲洗次数和药耗；其次会缩短管网的使用年限，增加配水动力费用；更重要的是，一些产毒素水华藻类（如微囊藻）会释放出藻毒素，长期摄入容易引发肝癌、肠癌等疾病，严重威胁人体的健康[1，2]。尽管目前已经开发出多种治理蓝藻水华的措施，包括物理打捞、喷洒化学除藻剂、黏土絮凝以及生物操纵等，但是这些除藻方法在经济性、安全性和高效性等方面仍存在局限性，甚至会造成二次污染。而超声波除藻由于其操作简便、能耗低、无二次污染等特点被认为是极具潜力的治藻技术，同时也是近年来的研究热点[3，4]。

目前国内外的研究均证明，超声波处理方法可以有效抑制藻类繁殖，且与其他除藻方法有机结合能够达到更理想的抑藻效果[5-8]。特别对于具有伪空泡的蓝藻，超声波处理对其的抑制作用更为明显。研究显示在超声波辐射后，微囊藻的沉降率明显高于其他藻类[9]，研究普遍认为由于微囊藻内部存在大量气囊，受到超声波的空化效应作用，内部气囊产生巨大压力而破裂，导致其失去浮力调节功能，最终下沉[10]。然而超声波对微囊藻的抑制作用不仅仅体现在简单的物理沉降作用，更是一个复杂而缓慢的生理生化作用过程。近年来，关于超声波对铜绿微囊藻细胞生理生化特性影响的研究报道较少，仅有的研究认为超声波能够有效破坏藻细胞吸收光能的天线复合物和叶绿素，减慢光合作用，从而抑制细胞生长[11]，并且诱导藻细胞发生脂膜过氧化反应，增加膜透性[9]。但是针对微囊藻抵御短时超声波胁迫的分子生物学应激反应机理的研究鲜见报道，在分子水平研究短时超声波对微囊藻蛋白质表达的影响机理了解甚少，一定程度上减缓了超声波除藻技术的发展。因此，本试验以长时间超声波对藻类聚集性和沉降性的作用机理作为参考，在此基础上，进一步将短时超声波作为藻类的胁迫因素，从分子生物学水平研究其引起的微囊藻蛋白质表达量和种类的差异，为确定短时超声波强化混凝除藻技术的作用机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养

试验选用的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是中国富营养化湖库最常见的水华蓝藻之一。藻种购于中国科学院水生生物研究所，编号FACHB-905，为产毒种类。培养温度27±1 ℃，光暗比12 L∶12 D，光照度36 μE/（m2·s），培养时间7 d，培养基为高压灭菌的BG-11培养基[12]。

1.2 试验装置

主要设备：JY92-IIN型超声细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；IPGhor型等电聚焦仪、DALT-SIX SDS-PAGE型电泳仪、ImageScanner扫描仪（GE Healthcare）。

其他设备：GZP-250型光照培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；LDZ-50KB型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司）；TG16-WS型高速离心机（湖南湘儀实验室仪器开发有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 短时超声波处理 采用BG-11培养基将菌种样品稀释到适当浓度，然后将超声波探头放入菌液中，进行80 kHz、60 W超声波处理5 s。

1.2.2 蛋白提取及测定 取适量菌样，加入1 mL蛋白质裂解液（PL039），进行超声波破碎（100 W，2 s，3 min），离心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）去除沉淀，加1 mL预冷丙酮（-20 ℃沉淀过夜），离心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）去除上清液，晾干沉淀，加入500 μL蛋白质裂解液（PL039），最后使用非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒（SK3071）进行定量测定。

1.2.3 双向电泳

1）第一向等电聚焦电泳。主要参照Bio-Rad等电聚焦系统操作指南进行，取400 μg蛋白质样品，加上样液（9 mol/L尿素，4% CHAPS，2%IPG缓冲液，40 mmol/L DTT，40 mmol/L Trisbase）至终体积450 μL，放入标准型胶条槽中。将17 cm IPG胶条胶面朝下覆盖在样品上，室温吸收1 h后，加2 mL矿物油覆盖。20 ℃下水化14 h，以50 μA电流和20 ℃聚焦温度进行等电聚焦电泳。

2）第二向SDS-PAGE电泳。等点聚焦结束后，胶条依次在平衡液Ⅰ（含6 mol/L尿素，2%SDS，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，30%甘油，0.25%溴酚蓝，5%DTT）和平衡液Ⅱ（含6 mol/L尿素，2%SDS，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，30%甘油，0.25%溴酚蓝，5.5%IAA）中各平衡15 min后进行电泳。电泳后银染显色。

1.2.4 图像扫描和分析 通过ImageScanner扫描仪获取电泳图像，采用PDquest 8.0软件进行分析。对图像进行背景消减、斑点检测、凝胶匹配，检出的蛋白质点进行归一化处理，相同位置的染色点进行丰度分析，通过软件计算蛋白质含量变化比值，变化比值在2倍以上的蛋白质点视为表达差异点。

1.3 MALDI-TOF-MS质谱分析与数据检索

制备好样品送生工生物工程（上海）股份有限公司进行质谱检测，检测仪器为Bruker Autofle MALDT-TOF-MS质谱仪。数据检索：质谱峰人工去除胰酶自切峰和角蛋白峰的污染后，将数据在网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov上进行搜索匹配。

2 结果及分析

2.1 蛋白质双向电泳分析

采用双向电泳技术对经过短时超声波处理的微囊藻总蛋白质进行分离，获得背景清晰且分离效果较好的2-DE图谱（图1、图2）。经过软件PDquest 8.0分析，短时超声波处理的蛋白质双向电泳凝胶图谱和对照组的显著蛋白质差异点有127个，其中56个蛋白质点下调，71个蛋白质点上调，另外有54个新增蛋白质点，21个消失蛋白质点。

2.2 差异表达蛋白质点的质谱鉴定

选取其中丰度大于2、分离效果清晰的26个差异蛋白质点进行质谱鉴定，鉴定成功的有8个，质谱鉴定结果见表1，其中有2个未知蛋白质和6个功能蛋白质。这些功能蛋白质参与抗氧化和抗炎症、磷酸盐合成、电子传递等多个生理过程，实现微囊藻在短时超声波胁迫下的代谢平衡和自我保护。

3 讨论

3.1 与抗氧化、抗炎症相关的蛋白

藻青蛋白α亚基片段。藻青蛋白质是蓝绿藻内的蓝色素，在活的藻细胞内，藻青蛋白质是蛋白质存储单位和抗氧化剂，防止细胞受到某些波长的伤害。有研究表明，藻青蛋白质有较强的抗氧化和抗炎症特性，在多种炎症动物模型内，藻青蛋白质可以减少或预防炎症。当微囊藻受到超声波胁迫时，藻青蛋白α亚基片段呈现出明显的差异表达，通过其抗氧化和抗炎症等特性，对微囊藻起到自我修复和保护的作用。

3.2 与光合作用相关的蛋白

1，5-二磷酸核酮糖合成酶亚基。1，5-二磷酸核酮糖是在光合作用中的卡尔文循环里起重要作用的一种五碳糖。植物体内的酶用1，5-二磷酸核酮糖作为底物来固定二氧化碳，生成六碳磷酸盐，这种高度不稳定的中间产物最终分解为两分子的甘油3磷酸。当微囊藻受到超声波胁迫时，可能其光合作用受到影响，从而造成该合成酶亚基出现差异表达。

3.3 与电子传递相关的蛋白

光系统PSⅠ复合体蛋白亚基。PSⅠ是光合电子传递链的一部分，位于类囊体膜的间质部分。当受到超声波胁迫时，光合电子的传递可能受到影响，从而引起该蛋白质的较大差异表达。

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