双向电泳分离水稻叶片蛋白实验教学的改进

王琳 杨晓勤 陈云

[摘 要] 为了改进水稻叶片蛋白的双向电泳分离方法，采用双向电泳法分离水稻叶片蛋白，比较和分析了两种上样量对实验的影响。改进的上样量灵敏度高，分离条带多且清晰，表明改进的实验方法可以得到更为灵敏、清晰的图谱，能更好地适应和促进实验教学工作。

[关键词] 实验教学;改进;双向电泳;叶片

[中图分类号] Q503     [文献标识码] A    [文章编号] 1674-9324（2020）41-0383-02    [收稿日期] 2020-04-02

目前，双向电泳技术是研究蛋白组学十分重要的技术手段，特别是以固相pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳技术是当前分辨率最高，信息量最大的电泳技术。它具有结果直观，分辨率较高，信息量大，技术成熟等优点，因此，此实验也成为本科生生物化学实验中的基础性实验，是生物化学实验教学的重要内容。

在双向电泳中，上样量大小取决于样品中蛋白质的种类、数目、检测方法的灵敏度及胶条的pH梯度范围和长度。不同样品中蛋白的种类、数目有一定差异，所以在检测方法相同，一向IPG胶条pH梯度范围和长度相同的条件下，不同样品的蛋白上样量有差异。为了获得一个分辨效果好和重复性好的双向电泳图谱，得到质量高的水稻叶片蛋白电泳分离效果，找出合适的蛋白上样量很重要。作者在使用双向双向分离水稻叶片蛋白实验的传统方法时发现，根据原来的蛋白上样量分离的蛋白斑点较少且模糊。为了提高水稻叶片蛋白的电泳分离效果，本文对此进行了探讨。

一、方法

（一）常规实验方法

首先采用三氯乙酸-丙酮法提取水稻叶片蛋白。将叶片研磨至叶片成粉末状，加入溶液A（10%三氯乙酸（TCA）和0.07%β-巯基乙醇的预冷丙酮溶07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液）悬浮沉淀。4℃，11000rpm离心15min，弃上清，重复两次，将最终得到的沉淀真空冷冻干燥，然后用Bradford法测定蛋白质含量，最后通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离水稻叶片蛋白。称取一定量的水稻叶片冻干样品，溶于裂解液中（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer 4-7，1%DTT），样品超声波处理五次，每次3-5s，间隔3s，于冰水中裂解30min，14000rpm离心20min，取上清，再离心，取上清，以充分去除杂质，获得的蛋白样品除少量用作浓度测定外，其余进行分装，于-80℃保存。每次用之前，将分装的蛋白样品取出，室温下解冻，根据所需总的蛋白质质量取一定体积的蛋白样品，分别加入相应水化液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，0.4%DTT，0.5%IPG buffer pH4-7或pH3-10），终体积为350μL，再加入微量溴酚蓝振荡混匀，2000rpm离心1min，将含样品的水化液均匀地加到水化盘中。第一向等电聚焦时，取pH4-7L，18cm干胶条，去掉保护膜，准备水化。把干胶条胶面朝下置于水化盘中水化，加入IPG覆盖液使整个IPG strip被覆盖。水化时间為10-12小时，温度20℃。取出水化好的胶条，胶面朝上置于持胶槽中，胶条正负极与持胶槽正负极要一致，并使胶条与持胶槽两端电极充分接触，加适量IPG覆盖液覆盖整个IPG strip。水化前把样品液加入水化液中。再根据合适的电泳参数进行等电聚焦。等电聚焦结束后，取出胶条，加入平衡液A（6mol/L尿素，0.05mol/LTris-HCI，2%SDS，30%甘油，0.1%DTT，0.002%溴酚蓝）振荡平衡15 min，再换平衡液B（6 mol/L尿素，0.5mol/L Tris-HCl，2%SDS，30%甘油，0.4%碘乙酰胺，0.002%溴酚蓝）振荡平衡15 min，取出胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡液，准备第二向电泳。采用分离胶浓度为12.5%的连续SDS-PAGE垂直平板电泳。将已平衡好的第一向胶条置于第二向凝胶的上方，排除气泡，使二者紧密接触。用1%琼脂糖凝胶封固胶条，接通电源，以15℃循环水浴冷却。15mA/块胶恒流电泳30min，待溴酚蓝前沿移至分离胶中后，再增大电流至30mA/块胶，待溴酚蓝前沿距凝胶板底0.5-1cm处，终止电泳。电泳结束后，将凝胶浸泡于固定液（40%无水乙醇，10%冰乙酸）中固定30min或过夜，倒去固定液，以双蒸水洗4次，每次15min，然后在染色液（0.12% CBB G-250，10% ammonium sulfate，10% phosphoric acid and 20% methanol）中染色3～4小时，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色30min，然后用蒸馏水漂洗数次直至背景颜色浅淡，蛋白质点清晰即可，扫描仪扫描胶图。具体方法参照王[5]等。

（二）实验方法的改进

常规的实验方法中的蛋白质样品上样量为100ug。改进的实验方法中蛋白质样品上样量为150ug。

二、结果与分析

本实验比较了100μg和150μg两个上样量的双向电泳分离水稻叶片蛋白效果，图1（a）上样量为100μg，图1（b）上样量为150μg，虽然图1（a）的背景较浅，但蛋白斑点明显少于图1（b），很多低丰度蛋白在图1（a）中无法检测到，而图1（b）中蛋白斑点相对较多，图1（a）中清晰的蛋白斑点在图1（b）中进一步加深，有些图1（a）中检测不到的点在图1（b）中检测到了。因此150μg的上样量比100μg的上样量更适合水稻叶片蛋白的双向电泳分离。

三、讨论

上样量大小对双向电泳总的蛋白质的覆盖率有很大的影响。控制好上样量，可以得到令人满意的双向电泳图谱，提高重复性，并有利于后续的进一步分析。上样量太小会造成蛋白点稀少，上样量太大会造成一向等电聚焦时电流太大，使得第一向电泳无法达到最佳分离效果;第二向电泳中出现严重拖尾等现象，对结果分析有很大影响。改进的上样量更有利于获得蛋白数量多、背景清楚、灵敏度高的凝胶图像，更适合双向电泳分离水稻叶片蛋白的实验教学。

四、结论

本实验方法克服了双向电泳分离水稻叶片蛋白传统方法的一些不足，如用100ug的上样量改进为150ug的上样量，得到了更为灵敏、清晰的实验结果，更好地适应和促进实验教学工作，也有利于其他老师从中得到启发。

参考文献

[1]陈文静，何海洋，邓秋菊，等.薄壳山核桃蛋白质测定方法比较以及双向电泳体系的建立[J].分子植物育种，2017，15（5）：1874-1880.

[2]张鹏飞，黄愉淋，耿双双，等.水牛睾丸曲精细管蛋白质组双向电泳方法的建立及优化[J].基因组学与应用生物学，2019，38（4）：1474-1479.

[3]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].第二版.北京：科学出版社，2005.

[4]梁宋平主编.生物化学与分子生物学实验教程[M].北京：高等教育出版社，2003.

[5]王琳，范云峰，粱建生.双向电泳中不同样品裂解液对水稻叶片疏水蛋白溶解效果比较[J].江苏农业科学，2017，45（18）：54-56.

[6]陈凌艳，赖金莉，张力等.适用于花叶唐竹叶片总蛋白的双向电泳体系的建立[J].分子植物育种，2019，17（7）：2303-2311.