生长抑制因子5逆转Warburg效应抑制肿瘤增殖的研究

刘新利++++张鸿飞+++张旭涛+++孟瑾+++张峰

[摘要] 目的 研究生长抑制因子5（ING5）对肺癌A549 细胞Warburg效应的影响。 方法 肺癌A549 ING5过表达细胞系通过慢病毒转染GV218-EGFP-ING5（吉凯基因）构建，空质粒转染为对照细胞系A549-control。Western blot验证ING5的表达；增殖和克隆形成实验观察ING5对A549细胞增殖和克隆形成的影响；乳酸脱氢酶（LDH）活性和乳酸（LD）分泌检测实验观察ING5对A549细胞Warburg效应的影响。 结果 Western blot结果表明，A549-ING5-OE的ING5表达显著高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。增殖和克隆形成实验结果表明，A549-ING5-OE的增殖和克隆形成能力较对照组显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。LDH活性和LD分泌检测实验结果表明，A549-ING5-OE的LDH活性和LD分泌较对照组明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 ING5通过逆转肺癌A549细胞的Warburg效应抑制其增殖。

[关键词] 肺癌细胞；生长抑制因子5；Warburg效应；增殖；克隆形成

[中图分类号] R730.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0004-04

代谢重组是诱导肿瘤发生发展的重要机制之一[1-2]。肿瘤组织在有氧条件下主要依赖糖酵解获能的代谢方式称为“Warburg效应”[3]。Otto Warburg首次发现并认为这种代谢方式的转变是促进癌变的主要诱因[4]。生长抑制因子（inhibitor of growth，INGs）是近年来发现的重要抑癌基因家族[5-7]，该家族包含ING1～5五个成员。INGs家族蛋白高度保守，由C端结构域、中央区和N端结构域三部分组成[8-9]。ING5是该家族新成员，研究发现ING5与P53相互作用能够抑制细胞生长和诱导细胞凋亡[10]。此外，有研究报道ING5能够抑制肿瘤增殖和上皮间质转化（EMT）[11]，同时诱导细胞周期阻滞，促进细胞分化、自噬和凋亡[12]。

目前关于ING5的研究报道较少，其抑癌作用及机制尚无突破性进展。本文拟研究肺癌A549细胞ING5过表达对Warburg效应及增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

A549细胞（上海中科院细胞库），GV218载体（上海吉凯基因化学技术有限公司），G418（美国Gibco公司），高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液（美国HyClone公司），青链霉素混合液（北京Solarbio公司），BCA试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、裂解液（西安碧云天科技生物有限公司），蛋白酶抑制剂（瑞士Roche公司），ING5抗体（美国Proteintech），ECL化学发光试剂盒（美国Advansta公司），兔二抗（英国Abcam公司），4%多聚甲醛溶液（西安科昊生物技术有限公司）。

1.2 肺癌A549-ING5-OE细胞株的构建

含ING5 cDNA的慢病毒载体和对照载体为吉凯公司构建。0.25%的胰酶消化293T细胞后计数并调整密度为6×105个/mL接种于培养皿，37℃，5% CO2孵箱培养至密度约80%進行转染。转染前2 h换无血清DMEM，加入转染复合物继续培养8 h后弃掉上清液，PBS清洗后加入10% FBS的DMEM继续培养48 h，收集上清液1000 r/min离心3 min，所得上清液为病毒颗粒浓缩液。取对数生长期肺癌A549细胞，用上述病毒颗粒浓缩液进行感染12 h后观察细胞状态，无明显细胞毒副作用则继续培养24 h后换新培养液，感染3 d后观察EGFP基因的表达。感染后的A549细胞计数并调整密度为300个/孔接种于6孔板内继续培养。用5 μg/mL的G418筛选，每隔24 h更换新培养液，筛选3 d后用荧光显微镜观察细胞克隆，挑取阳性克隆扩大培养至所需细胞量。

1.3 Western blot检测ING5的表达

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞，0.25%的胰酶消化，4℃预冷的PBS洗涤、离心后加入适量裂解液混匀冰上裂解30 min。细胞裂解液组成：0.1%SDS、150 mmol/L NaCl、0.5%脱氧胆酸、1%NP-40和50 mmol/L Tris（pH 8.0），裂解前加入蛋白酶抑制剂（1∶25），低温离心机离心30 min后所得上清为细胞总蛋白，BCA试剂盒定量。采用SDS-PAGE凝胶试剂盒配制10%分离胶和6%浓缩胶，上样后开始电泳（浓缩胶100 V，30 min，分离胶130 V，1 h），转膜（100 V，1.5 h），后取出NC膜，10%丽春红染液染色30 s可见清晰的红色条带，裁剪目的条带用PBST洗脱残余染液，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后孵育一抗ING5（1∶1000）、Actin（1∶1000），4℃过夜。次日，回收一抗，PBST清洗目的条带3次，7 min/次。山羊抗兔或鼠二抗（1∶5000）室温孵育1 h，PBST清洗目的条带3次，7 min/次。化学发光仪检测目的蛋白的表达。

1.4 细胞增殖实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞，0.25%胰酶消化计数后，10% FBS的DMEM配成单细胞悬液，以每孔2×103个/200 μL接种于96孔板中培养，6个复孔。细胞贴壁开始计时24、48、72、96、120 h每孔加MTT溶液（5 mg/mL，PBS配制）20 μL继续孵育4 h后终止培养，弃上清，每孔加150 μL DMSO，震荡仪振荡10 min使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪490 nm测定OD值，以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.5 克隆形成实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞，0.25%的胰酶消化计数后，10% FBS的DMEM配成单细胞悬液，以每孔300个/2 mL接种于6孔板中培养，3个复孔。细胞贴壁生长5 d后每孔加500 μL FBS继续培养并观察克隆形成情况，待肉眼观察菌落形成后（14 d左右），弃上清，PBS清洗3次，加1 mL 4%多聚甲醛溶液室温固定15 min。弃固定液，PBS清洗3次，加0.1%结晶紫染液室温染色15 min。弃染液，PBS清洗3次，室温风干后计数超过50个细胞的克隆。

1.6 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞，0.25%的胰酶消化、4℃预冷的PBS洗涤、离心后加适量裂解液混匀冰上裂解30 min，低温离心机离心30 min，所得上清液为细胞总蛋白，BCA试剂盒定量。根据OD值及线性回归方程计算初始蛋白初浓度，裂解液调整蛋白终浓度为3 μg/μL。按照说明书进行实验操作，酶联免疫检测仪450 nm读取OD值，每组3复孔，重复3次独立实验。

1.7 乳酸（LC）分泌检测实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞，0.25%的胰酶消化计数后，10% FBS的DMEM配成单细胞悬液，以每孔4×105个/mL接种于6孔板中培养，24 h后收集上清液。按照说明书进行实验操作，酶联免疫检测仪530 nm读取OD值，每组3个复孔，重复3次独立实验。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测ING5的表达

Western blot结果表明：与A549-control相比，A549-ING5-OE的ING5表达明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.2 ING5抑制A549细胞的增殖

增殖实验结果表明：与A549-control相比，A549-ING5-OE的增殖能力显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。

2.3 ING5抑制A549细胞的克隆形成

克隆形成实验结果表明：与A549-control相比，A549-ING5-OE的克隆形成能力显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.4 ING5抑制A549细胞的LDH活性

LDH活性检测结果表明：A549-ING5-OE的LDH OD450值为（0.268±0.013），较A549-control的OD450值（0.333±0.015）明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.5 ING5抑制A549细胞的LD分泌

LD分泌实验结果表明：A549-ING5-OE的LD分泌OD530值为（0.257±0.016），较A549-control的OD530值（0.302±0.012）明顯降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

3 讨论

肿瘤在有氧条件下以糖酵解获能的代谢特征称为Warburg效应[13]。Warburg认为代谢的异常导致了肿瘤的发生发展[14]。此外，Warburg效应导致的局部酸性微环境与肿瘤的浸润转移有明显的相关性[15-16]。Flaveny等[17]研究发现逆转Warburg效应可阻断癌症发展。

近年来INGs蛋白家族在肿瘤中的作用及机制受到高度重视。Liu等[18]发现，ING5与HAT酶Tip60相互作用后诱导凋亡基因Bax和GADD45转录激活促进细胞凋亡。此外，研究发现在口腔鳞状细胞癌[19]、胃癌[20]、乳腺癌[21]和结直肠癌[22]等多种肿瘤中，ING5 mRNA和蛋白水平均显著降低。

本文拟研究ING5过表达对肺癌A549细胞Warburg效应及增殖能力的影响。结果表明，ING5过表达能够显著抑制细胞增殖和克隆形成，同时，首次发现其能够抑制细胞LDH活性和LD分泌抑制糖酵解。提示ING5能够逆转Warburg效应并为肺癌代谢治疗提供新的依据。

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（收稿日期：2016-11-10 本文編辑：程 铭）