细胞类固醇合成酶的影响

赵晓光++李厚忠++孟娜娜++王利强++杨永涛++杜美超++张羽飞

二甲磺酸乙烷对成年大鼠睾丸间质不同时间点

[摘要] 目的 研究二甲磺酸乙烷（EDS）注射对雄性大鼠睾丸间质细胞类固醇关键合成酶表达的影响，并进一步了解EDS对大鼠睾丸间质细胞类固醇关键合成酶可能的调节机制。 方法 将25只90 d雄性SD大鼠随机分为两组，对照组（0 d，n = 5）一次性腹腔内注射生理盐水，EDS组（n = 20）一次性腹腔内注射EDS 70 mg/kg体重。EDS组注射后7、21、35、90 d后取血清和睾丸组织，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清及睾丸中的睾酮水平，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹方法（Western blot）分别检测睾酮合成相关基因类固醇急性调节蛋白（StAR）、胆固醇侧链裂解酶（P450scc）、3β-羟基类固醇脱氢酶1型（3β-HSD1）、P45017α-羟化酶1（P450c17a1）、17β-羟基类固醇脱氢酶3型（17β-HSD3）mRNA和蛋白表达水平。 结果 与对照组比较，EDS处理7 d后，睾丸内的睾丸间质细胞几乎完全被破坏，导致睾酮水平急剧下降（P < 0.01），睾酮合成相关酶StAR、3βHSD、P450scc、P450c17、17β-HSD3的mRNA及蛋白表达水平均显著下降（P < 0.01），而处理21、35 d后，上述相关酶mRNA及蛋白表达水平均有所回升（P < 0.01或P < 0.05），处理90 d后，上述相关酶基因及蛋白的表达水平已经基本上恢复到与对照组相近的水平，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 EDS能够特异性地破坏雄性SD大鼠睾丸组织中的睾丸间质细胞，EDS的此种效应对研究睾丸间质细胞缺失下睾丸功能的变化进而研究精子发生的内分泌调控均有较大意义。

[关键词] 睾丸间质细胞；二甲磺酸乙烷；睾酮；类固醇合成酶

[中图分类号] R339.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0015-04

睾丸间质细胞（Leydig cell）是哺乳动物睾丸間质中的一种重要的内分泌细胞，具有合成和分泌体内超过90%睾酮的功能，对于雄性的生育能力及第二性征的维持至关重要，是男性体内雄激素的最主要来源。Leydig的发育、数量及雄激素合成功能对男性的各个方面都具有决定性的影响[1]。二甲磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）作为一种细胞毒性烷化剂，在20世纪80年代即已证实可以选择性地杀死成年大鼠睾丸中的Leydig细胞，被认为是研究Leydig细胞再生的候选药物之一[2-3]。目前，国外采取EDS建立模型研究Leydig细胞再生及其相关研究的报道较多[4-7]，但国内报道相对较少，因此，本研究通过观察一次性腹腔注射EDS对成年大鼠Leydig细胞的作用，测定EDS对处理后不同时间点大鼠睾丸Leydig细胞类固醇关键合成酶类固醇合成快速调节蛋白（StAR）、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（P450scc）、3β-羟类固醇脱氢酶1（3β-HSD1）、P45017α-羟化酶1（P450c17a1）、17β-羟类固醇脱氢酶3（17β-HSD3）在转录水平和翻译水平表达的影响，为利用EDS建立体内Leydig细胞再生模型的建立提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂仪器

90 d SPF级健康雄性SD大鼠，体重250～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK京2012-0001。主要试剂：EDS（纯度>97%，洛克菲勒大学Renshan Ge教授惠赠）；睾酮酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；RNA提取试剂盒（美国Omega公司）；逆转录试剂盒（美国Promega公司）；SYBR Green试剂盒（美国Promega公司）；PCR引物（上海生物工程有限公司）；抗体（美国Abcam公司）。主要仪器：荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；台式低温高速离心机（德国Sigma公司）；超微量核酸蛋白测定仪（美国Thermo Fisher公司）；全自动酶标仪（美国Molecular Devices公司）等。

1.2 实验方法

将25只实验大鼠随机分为两组，对照组（0 d，n = 5）一次性腹腔内注射生理盐水，EDS组（n = 20）一次性腹腔内注射EDS 70 mg/kg体重；EDS组注射后于第7、21、35、90天结束，于相应时间点固定时间处死大鼠（每组5只），采集血清和睾丸组织，用ELISA测定血清中及睾丸中的睾酮水平，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹方法（Western blot）分别检测睾丸组织内睾酮合成相关基因StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1、17β-HSD3基因和蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

本文数据采用Graphpad Prism 5.0统计软件进行分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，组间两两比较采用Dunnett检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EDS对大鼠血清及睾丸内激素水平的影响

EDS处理7 d后，大鼠血清中及睾丸内睾酮水平浓度急剧下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01），21 d后，浓度均有所回升，到35 d，已经分别恢复到对照组水平的71%和75%，到90 d，浓度均已经基本上恢复与对照组相当的水平（分别为109%和97%）。见图1。

2.2 EDS暴露后对睾丸内相关基因相对表达水平的影响

随着EDS处理时间的延长，各基因的表达趋势基本一致。EDS处理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3 mRNA水平较对照组急剧降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。而后随着EDS处理时间的延长，浓度呈上升趋势，处理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表达分别回升24%、15%、61%、38%和60%（P < 0.01或P < 0.05），处理35 d后分别回升了43%、28%、80%、60%和77%（P < 0.01）（3β-HSD1、17β-HSD3表达差异无统计学意义），到处理90 d后，上述指标表达水平与对照组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 EDS暴露后对睾丸内相关蛋白表达的影响

EDS处理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1和17β-HSD3蛋白的表达水平较对照组急剧降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。而后随着EDS处理时间的延长，各蛋白的表达量呈上升趋势，到90 d，与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。处理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表达分别回升47%、80%、43%、55%和52%（P < 0.01）（P450scc表达差异无统计学意义），处理35 d后分别回升了72%、56%、80%、60%和76%（P < 0.01或P < 0.05）（P450scc表达差异无统计学意义），到处理90 d后，分别回升了79%、75%、80%、71%和80%，与对照组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

Leydig细胞在其分化发育中有4个显著不同的阶段：睾丸间质干细胞（SLC）、睾丸间质祖细胞（PLC）、未成熟睾丸间质细胞（ILC）和成熟睾丸间质细胞（ALC）[8，15-16]。Leydig细胞合成和分泌的睾酮是一系列酶促反应，其主要依赖于StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3等关键酶的调控[9-10]。其中StAR主要参与类固醇合成的早期调节，被认为是睾酮合成起始限速步骤，P450scc被认为是睾酮合成的限速步骤，它主要是将转入线粒体内的胆固醇转化为孕烯醇酮，并在3β-HSD1作用下形成孕酮，后者再经p450c17a1进一步催化生成雄烯二酮，后者在17β-HSD的作用下，最终生成睾酮[11-13]。因此，Leydig细胞合成睾酮过程中的关键酶表达降低的直接结果必然是引起单个细胞合成睾酮的表达能力明显降低，从而影响睾酮的合成和分泌[14-16]。EDS是具有Leydig細胞特异性“敲除”的化合物。

EDS可以暂时杀死成熟的Leydig细胞，其后伴随是Leydig细胞再生的过程，这种再生过程与人类青春期Leydig细胞的分化过程相类似。马学等[17]给予新生雄性SD大鼠腹腔注射EDS后，建立了“敲除”胚胎睾丸间质细胞（FLC）模型，并确定了EDS有效和安全的剂量，为深入研究FLC和ALC之间的关系做了很好的前期研究基础。张磊等[18]研究表明大鼠和小鼠EDS处理的生精小管体外培养模型能够很好地模拟SLC在体内的发育分化过程，弥补了细胞和动物实验在研究SLC发育分化中的不足，建立了一个非常有价值的研究模型，尤其是在筛选和评估不同外源物质对SLC分化发育的影响研究有重要的作用。笔者也在前期的研究中利用EDS建立了“敲除”Leydig细胞模型的实验，研究了再生后的Leydig细胞的基因表达情况[19-20]，为后续研究Leydig细胞发育生物学奠定了基础。

本研究利用EDS处理大鼠后，分别在第0、7、21、35、90天检测血清中和睾丸内睾酮水平，并用qRT-PCR和Western blot检测了相应时间点类固醇合成关键酶StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17和17β-HSD3基因和蛋白表达水平。结果显示，这些酶的转录和翻译水平在EDS处理7 d时迅速下降，随着处理时间的延长都呈回升趋势，表达趋势呈一致。表明，大鼠腹腔注射EDS 7 d后睾丸ALC被杀灭，但SLC仍然存在，逐渐增殖分化，Leydig细胞又会再生。结果与既往理论也不谋而合，即Leydig细胞的发育经历4个阶段：干细胞（第0天）、祖细胞（第7天）、未成熟细胞（第21天）和成熟细胞（第90天）。

以上结果提示，EDS可以作为建立去除Leydig细胞模型的候选药物，并且该模型也可以作为进一步深入研究Leydig细胞发育生物学研究的动物模型，同时该模型对研究Leydig细胞缺失，进而导致睾丸功能的变化以及精子发生的内分泌调控均有较大意义。

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（收稿日期：2016-10-11 本文编辑：张瑜杰）