大头典竹叶片蛋白质组学双向电泳技术体系的优化

陈思凯+瞿印权++杨德明+陈剑成+宋鲲鹏++刘家琪+何天友++荣俊冬++郑郁善++陈礼光

摘 要：目的：为了获得清晰的蛋白凝胶图谱，建立适用于大头典竹蛋白组学双向电泳的优化体系。方法：对大头典竹蛋白提取方法、胶条的水化运行方式、等电聚焦（IEF）程序的设置、蛋白上样量等步骤进行优化。结果：大头典竹的蛋白斑点主要分布在pH5～8的范围；三氯乙酸-丙酮法与酚抽结合法更适合大头典竹蛋白的提取；IPG胶条胶面向上、被动水化方式、蛋白上样量为50μL，效果更好。结论：通过建立双向电泳（2-DE）的优化体系，获得的蛋白点均匀、清晰、横纵条纹少的凝胶图谱，提高了分辨率，为大头典竹差异蛋白组学研究奠定了基础。

关键词：大头典竹；双向电泳；蛋白组学

中图分类号 Q946-33 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）05-0041-05

Abstract：[Objective]In order to obtain a clear protein gel electrophoresis，the optimal two-dimensional electrophoresis system suitable for D.beecheyana var. pubescens was established. [Methods]The total protein extraction method，hydration operation mode of strip， program arguments setting of isoelectric focusing and protein amount were optimized to establish an optimal two-dimensional electrophoresis system suitable for D.beecheyana var.pubescens. [Results] Bamboo protein spots were mainly distributed in the scope of the pH5-8. Using trichloroacetic acid - acetone method combined with phenol extraction method is more suitable for the extraction of the D.beecheyana var. pubescens protein. Placing the surface of strip up-side down， passive hydration mode，50μL amount of protein is benefit to obtain optimal effect of gel electrophoresis.[Conclusion] Through the establishment of two-dimensional electrophoresis （2 DE） the optimization of the system， obtaining protein point uniform，clear， map of transverse and less longitudinal stripes gel electrophoresis and improving the resolution，provided the basis for further studies of the proteomics for D.beecheyana var.pubescens.

Key words：D.beecheyana var. pubescens；Two-dimensional electrophoresis；Proteomics

大头典竹（Dendrocaiamopsis beecheyana Var pubescens P.F.Li）别名新竹、大头竹，属禾本科竹亚科绿竹属。大头典竹具有成活率高、生长快、适应能力强等特点，大型的丛生竹大头典竹已成为福建漳州东山岛主要的蓄水防风树种，具有很強的土层固沙能力[1]，完全适合在沿海沙地生长[2]。目前，对大头典竹的研究停留在生理水平上，而从分子水平上研究大头典竹的机理至关重要。

蛋白质是构成生物体细胞、组织的重要组成部分之一，是生命活动主要的承当者[3]。蛋白质在生命过程中扮演着重要的角色，是生命代谢活动的体现者，协助参与完成生命中的各项活动。随着植物基因组研究的不断深入，有关蛋白质组学的研究逐渐成为了人们关注的重点。构建一个可行、可信的蛋白质技术的优化体系，来分析蛋白质组学的差异性研究是至关重要的。蛋白质组学（Proteomics）的概念最早是于1994年由Wilkms和Williams等首次提出[4]，并于1995年在Electrophoresis杂志中提到蛋白质学的概念。蛋白质组学是一门从整体蛋白质水平上去研究生命重要活动的学科。随着蛋白组概念的提出，蛋白质学已经为基因表达类复杂问题提供了相当有效的解决方法[5]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试材料 从福建省漳州东山岛赤山林场截取大头典竹1～2年生侧枝扦插培育，以大头典竹长出的新叶作为实验的材料。

1.1.2 实验试剂 17cm的干胶条、碘乙酰胺（lodoacetamide）、1.5MTris-HCl8.8、1.0MTris-HCl6.8、两性电解质（Bio-Lyte，3-10，5-7）、硫脲（Thiourea）、过硫酸铵（AP）、尿素（Urea）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二硫代苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）购于美国Bio-Rad公司；矿物油（Mineral-oil）、二甲氨基丙磺酸内盐（chaps）、四甲基乙二胺（TEMED）、低熔点琼脂糖（low-Agarose）、硫代硫酸钠（Sodium thiosμLfate）购于美国GE公司；β-巯基乙醇（β-Mercaptoethano）、溴酚蓝、无水乙醇、冰乙酸、无水糖酸钠、甘油、三氯乙酸（TCA）等为国产公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大头典竹全蛋白的提取 本实验采用了TCA丙酮法[6]、酚抽法[7]、参改良的SDS酚抽法[6]進行微动修改。称取大头典竹新鲜叶片0.2g，剪碎加入到球磨仪配套的2mL的离心管中，每管0.2g，并在管中加入少量的交联聚维酮（PVPP）。液氮中冷却后放入球磨仪中研磨成粉末。转移至2mL的离心管中，放入液氮中冷却。加满10%TCA/丙酮溶液，涡旋震荡。4℃的条件下，1RPM的转速，离心10min，去除上清液。重复用80%甲醇和0.1mol醋酸铵溶液、80%丙酮溶液清洗。风干干燥30min加入Tris-饱和酚和SDS提取液，涡旋震荡，离心，吸取上层酚相，加满甲醇醋酸铵溶液，-20℃冰箱静置，待沉淀后离心，去除上层清液，风干干燥。分别依次加入100%的甲醇和80%丙酮涡旋、震荡、离心。重复2次，直至洗干净。风干干燥30min，即得到白净的蛋白干粉。

1.2.2 蛋白的裂解 称取10mg的蛋白干粉，以1mg加50μL裂解液的比例，加入500μL的裂解液，涡旋震荡10min。超声5min，冰浴5min。4℃、17000×g条件下离心10min后，吸取上层清液，即纯净的蛋白。

1.2.3 蛋白的定量 Brafford法测定样品中蛋白质含量，以牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白。

1.2.4 双向电泳分析

1.2.4.1 IEF 从超低温冰箱中拿出17cm的IPG干胶条放置在滤纸上15min左右，以恢复室温。从-80℃冰箱中取出保存好的样品蛋白，加入到配置好的水上样缓冲液中。小心吸取混合均匀的水化上样液缓缓地加入到水化盘中。剥开固相PH梯度（IPG）干胶条保护膜，将准备好的胶面向下轻盖于上样液上。来回晃动IPG胶条，确保胶条与水化液充分接触。放置室温条件让IPG胶条吸收10min，在水化盘的凹槽中沿着边沿加5mL的矿物油，水化24h后，进行等点聚焦。

1.2.4.2 胶条的平衡 等点聚焦后，将IPG胶条直立在滤纸上2min，待胶条上甘油吸尽后，转移至干净的水化盘中，加入平衡液1（36g尿素、2Gsds、25mL Tris、20mL甘油），平衡15min后，在滤纸上吸干平衡液1后，转移至平衡2液中，平衡15min。再将胶条转移至第二向SDS-PAGE胶上。

1.2.4.3 SDS-PAGE 分离胶浓度为10%，蛋白分析软件为PDQURST8.0.1。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白提取方法的比较 在大头典竹蛋白组学的研究中，蛋白样品的制备是研究蛋白组学基础而核心的步骤之一，是获得清晰蛋白点的重要技术手段[6]。全蛋白的提取质量直接或间接地影响到双向电泳凝胶图谱的结果[7]。因此，为了减少大头典竹蛋白提取过程中蛋白的丢失，提高蛋白的浓度和纯度，选择和优化一套适合大头典竹蛋白的提取方法是至关重要的。本实验称取0.2g的大头典竹叶片，研磨粉碎后采用3种不同的蛋白样品制备方法，经SDS-PAGE检测后，结果见图1。TCA丙酮法蛋白的条带模糊，分子量在65kD以上的条带基本看不清。Tris-酚抽法和SDS酚抽法获得的蛋白条带没有明显的差异，SDS酚抽法得到的条带颜色相对更深些，蛋白分子量在15kD条带有所差异。

TCA丙酮法是提取蛋白样品较为常见的方法之一，方法简单，易操作，但存在沉淀蛋白质互溶问题，样品中非蛋白成分很难除去，造成蛋白丢失且残留着较多的杂质[8]。通过对比3个凝胶图像，可以很明显看出，TCA丙酮法提取蛋白的电泳图谱并不太理想，蛋白斑点少，丢失严重（图2）。经PDQUEST8.0.1软件检测，TCA丙酮法提取大头典竹蛋白得到的蛋白斑点仅为168个。从图2-B可以清晰的看出，Tris-酚抽法提取大头典竹相比于TCA丙酮法蛋白斑点明显增多。根据相似相溶原理，酚抽法能溶解大部分水溶性蛋白，提出的蛋白纯度较高[9]。该方法在处理含大量干扰物质的植物样品中非常有效。经PDQUEST8.0.1软件检测，酚抽法提取大头典竹蛋白得到401个蛋白斑点。三氯乙酸-丙酮法与酚抽结合法得到的蛋白斑点为647个，蛋白斑点多而均匀。该方法有效地降低了提取蛋白中的杂质，提高了蛋白的获取数量。因此，三氯乙酸-丙酮法和酚抽结合法更适合大头典竹蛋白的提取。

2.2 不同IPG胶条水化方式的比较 双向电泳的技术优化目的是为了更好地分离蛋白点，得到较为清晰的凝胶图像。而胶条的水化和运行方式会直接影响到蛋白水化液上样的均匀程度，进而影响蛋白的上样结果。本实验采用胶面向上和胶面向下两种等电聚焦模式，并以主动水化和被动水化两种运行方式作比较，优化出最适合大头典竹蛋白上样的方式。

经软件pdquest8.0.1检测，胶面向下被动水化（图3-A）、胶面向上被动水化（图3-B）、胶面向下主动水化（图3-C）的蛋白点数分别为647个、718个、362个。从图片也可以明显地看出，胶面向上聚焦方式（图3-B）相比于胶面向下聚焦方式（图3-A），蛋白斑点更多且更清晰。在第一向电泳IEF聚焦过程中，胶面向上聚焦方式能减少胶条在聚焦时气泡的产生。因此，在胶条的运行方式上，选择胶条胶面向上的等电聚焦方式更加适合大头典竹蛋白组学的研究。

对比于胶面向上被动水化（图3-B）和主动水化（图3-C）的运行方式，主动水化的蛋白点明显少于被动水化方式的蛋白点。主动水化蛋白点丢失严重，经检测蛋白点数只有362个。选用胶面向上被动水化的运行方式分离效果最佳，得到更加清晰的蛋白点。因此，我们选用胶面向上被动水化的运行方式进行蛋白组学双向电泳技术优化的进一步研究的手段。经验证，IPG胶条胶面向上、主动水化的效果最优的结果与丁鹏[10]研究的结果保持一致。

2.3 等电聚焦（IGE）程序的确定 为了得到最佳的双向电泳结果，本实验对电泳聚焦程序进行了优化。参照BIO-RAD双向电泳默认的2-DE程序，采取多种参数组合方式设置了5个不同聚焦参数的程序设置，详见表1。

3 结论与讨论

要获得纯度浓度较高的大头典竹叶片全蛋白，实验用了3种不同全蛋白提取方法，TCA/丙酮法操作相對简易，得到的蛋白纯浓度较低。酚是一个很好的蛋白质溶剂，SDS-酚抽法不仅提高大头典竹叶片的蛋白提取效率，而且能得到纯净度较高的蛋白质；IPG胶条胶面向上的65 000hv的聚焦方式得到的较好的凝胶图谱，等点聚集程序聚焦时间不充分或是过度聚焦，凝聚图谱都有可能产生横条纹和纵条纹，不利于后续软件匹配分析；大头典竹的蛋白点主要分布在pH4.5～8.5，选择pH5～8的胶条，低分度蛋白主要集中在pH8附近，选择pH5～8的胶条更有利大头典竹蛋白点的分析；50μL的蛋白上样量凝胶蛋白点均匀、清晰。

本实验通过建立大头典竹叶片蛋白的双向电泳的优化体系，旨在获得蛋白丢失较少，蛋白斑点均匀、清晰凝胶图谱，为大头典竹蛋白组学的深入研究奠定基础。

参考文献

[1]林爱玉，涂志华，上官保国，等.沿海沙地引种竹子和木麻黄固沙功能比较研究[J].福建林学院学报，2013，01：28-33.

[2]张梅.滨海沙地竹林生态系统特性的研究[D].福州：福建农林大学，2004.

[3]Wasinger VC，Cordwell S，J，Cerpa}'oljak A，et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes：Mycoplasma gerritaliuua[J].L，lectro-phoresis，1995，16：1090-094.

[4]Zivy M，Devienne D.Proteomics：a link between genomics，genetics and physiology[J].Plant Mol Biol，2000，44：75-80.

[5]Canovas F M，Dumas-Gaudot E，Recorbet G，Et al.Plant nroteome analysis[J].Proteomics，2004，4：285-298.

[6]Shaw M M，Riederer B M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis[J].Proteomics，2003，3（8）：1408-1417.

[7]陈晶瑜，郭宝峰，何付丽，等.适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较[J].中国农学通报，2010，26（23）：97-100.

[8]Damerval C，Vienne D D，Zivy M，et al.Technical improvement in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling protein[J].Research Gate，1986，7（1）：52-54.

[9]陈晶瑜，郭宝峰，何付丽，等.适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较[J].中国农学通报，2010，26（23）：97-100.

[10]丁鹏.不同盐度胁迫下绿竹差异蛋白质组学研究[D].福州：福建农林大学，2015.

[11]Wang X N，Zhuo-Fuli L I.Optimization of Two Dimensional Electrophoresis System of Proteins in the Seedling Rhizom in Wheat[J].China Biotechnology，2008，28（12）：66-71.

（责编：张宏民）