外泌体在肺癌微环境形成及诊治中作用的研究进展

张宇，闫振锋，陈刚

(河北医科大学第三医院，石家庄 050000)

外泌体在肺癌微环境形成及诊治中作用的研究进展

张宇，闫振锋，陈刚

(河北医科大学第三医院，石家庄 050000)

外泌体是由直径为30～150 nm含有膜蛋白的脂质双分子层形成的空腔，包含蛋白、核酸、脂质、碳水化合物等多种物质。外泌体不仅在细胞间传递活性物质，还参与细胞活动的调节，是肺癌微环境形成中的重要参与者，在免疫逃避、免疫应答、成纤维细胞和间充质细胞向成肌纤维细胞分化、肺癌上皮细胞间质转化等多方面发挥作用。外泌体获得途径广泛，显示出较高的癌症靶向治疗的特异性，是一种具有极好前景的诊治手段。

外泌体；肺癌；肺癌微环境；上皮细胞-间充质转化；间充质干细胞

1986年，Johnstone等对绵羊红细胞上清液进行超速离心，发现了一种直径30～150 nm的双层膜囊泡状结构小体，即外泌体；他们提出外泌体由红细胞分泌，红细胞成熟后，通过外泌体将自身代谢废物排出胞外。于是，外泌体与红细胞的关系研究成为热点。1996年，有研究者发现，EB病毒转化的人B细胞内有一种富含主要组织相容性复合体Ⅱ类分子的腔室，腔室内有一些囊泡状结构的小体，与红细胞内的外泌体形成和排出过程相似，这种囊泡被认为是来源于B细胞的外泌体。此后研究者又发现，肿瘤细胞、树突状细胞、肠上皮细胞等都能分泌外泌体，外泌体的作用不仅仅是红细胞处理组织废物的运输体，其在免疫调节、肿瘤转移微环境形成等多个方面发挥作用，随后引起多领域研究者的关注[1]。1889年Paget曾针对肿瘤的发生机制提出了种子-土壤假说，一百多年来，在肿瘤转移机制研究方面并未取得突破性进展。2015年，Hoshino等[2]发现肿瘤细胞释放了数百万携带着它们蛋白质和遗传物质的外泌体到拟转移的目的器官，并触发了这些器官中必要的分子反应，如炎症、血管形成等，使肿瘤细胞到达后可以增殖。这一理论的提出，支持了Paget的“种子与土壤”学说，推进了对肿瘤转移机制的研究，提示外泌体是肿瘤微环境形成中的重要载体。现就外泌体在肺癌微环境形成及诊治中的作用研究进展情况综述如下。

1 外泌体特性及其内容物

外泌体直径为30～150 nm，在蔗糖密度梯度溶液中密度为1.13～1.21 g/mL范围富集。外泌体由含有膜蛋白的脂质双分子层形成空腔，其内含有蛋白、脂质、核酸等物质。外泌体存在于血液、唾液、尿液、母乳等体液中，可通过生理屏障[3]，是活细胞分泌的来源于晚期核内体(多囊泡体)的膜性囊泡。一般情况下细胞内较大的微囊泡是从质膜上直接分离而来的，而外泌体则来源于细胞内的核内小体，通过胞外分泌途径产生。外泌体也存在于体外培养的细胞培养液中。

1.1 外泌体所含的蛋白 有超过4 600种蛋白与外泌体相关，这些蛋白来自胞质、质膜，高尔基体及内质网[4]。大部分外泌体包含以下蛋白：①膜运输和融合蛋白，如GTP酶、Rab蛋白、膜联蛋白、脂筏标志性蛋白；②四跨膜蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82；③参与多泡体生物合成的蛋白，如Alix蛋白、TSG101；④热休克蛋白(HSPs)，如Hsp60、Hsp70、Hsp90；⑤脂质相关蛋白、磷脂酶；⑥细胞骨架蛋白，如肌动蛋白、微管蛋白和膜突蛋白[5]、四跨膜蛋白、Alix蛋白、TSG101、Rab5b蛋白。

1.2 外泌体所含的核酸物质 外泌体的一个鲜明特点是携带了大量核酸物质，包括miRNAs、mRNA、线粒体DNA(mtDNA)、piRNAs、长链非编码RNAs、核糖体RNAs、小核仁RNAs、核仁小RNAs及转移RNAs[6]。外泌体miRNA与癌的病理类型有关，其种类和数量由其亲本细胞决定，反映亲本细胞miRNA的内容，提示外泌体选择性包装miRNA。外泌体携带的mRNA被降解成至少200个片段，却能在体外翻译成完整蛋白[7]，提示外泌体与目标细胞融合后，其携带的mRNA可以翻译成蛋白。外泌体携带功能性核酸物质，与肿瘤微环境或远隔转移部位的细胞进行膜融合，将生物信息传递给这些细胞，发挥抑癌基因或癌基因作用。

1.3 外泌体所含的脂质 外泌体是由脂质双分子层形成的囊泡，包含的脂质有以下几类：①脂质筏相关脂质，如胆固醇；②甘油二酯类；③鞘脂类，如神经鞘磷脂和神经酰胺；④磷脂；⑤甘油磷脂类，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸；⑥聚甘油磷脂[8]。外泌体的脂质种类不同于其亲本细胞，鞘磷脂的含量、PS、PI、神经酰胺、胆固醇的含量增加，而磷脂酰胆碱含量降低。这些脂质结构保证了外泌体在体液和细胞培养基中的稳定性。外泌体外表面磷脂酰丝氨酸的存在，使接收细胞识别并接纳外泌体。同时，外泌体也是功能性脂质的载体，使大量具有生物活性的脂质存在于肿瘤微环境中，以利于肿瘤的增殖、免疫逃逸，如前列腺素类[9]。然而，在肿瘤微环境中外泌体也可能携带具有抗癌作用的脂质，如二十二碳六烯酸、ω-3多不饱和脂肪酸，这些抗癌物质可以影响肿瘤细胞间的交流，抑制肿瘤生长，并提高肿瘤对治疗的敏感性[10]。

1.4 外泌体所含的碳水化合物 尽管外泌体膜表面的糖基也参与细胞和外界环境的交流，但关于外泌体中碳水化合物的研究却较少。糖基化是常见的蛋白翻译后修饰方式，针对蛋白N-端和O-端糖基化研究较多。多项研究[11,12]表明，外泌体中富含特异的糖基化的糖复合物。

1.5 外泌体的提取方法 在过去5年间，对于外泌体的研究呈指数增长，从其在人体的生理功能到作为诊断标记物的潜在可能性全面展开，于是完整提取、分离外泌体成为研究的关键一环。细胞可分泌多个类型的外泌体，它们具有共同的生理、生化特性，有研究者使用了多种方法试图将具有同质性的一组外泌体纯化，但目前尚未发现较好的方法[13]。目前，有几种方法用于从体液或细胞培养液中提取分离外泌体，包括差速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法、免疫亲和捕获及聚乙二醇介导的沉淀法。

2 外泌体在肺癌微环境形成中的作用

肺癌是全世界发病率及病死率最高的肿瘤,其5年生存率仅18%，其早期无特异性临床症状，且缺乏有效的检测手段，影响了早期肺癌的检出率。而晚期肺癌，生存率极低，ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌使用基于铂类的化疗方案，中位生存期仅为12个月。肺癌的形成和发展受多种因素、机制的影响，是一个长期、复杂的过程。癌基因或抑癌基因的突变导致正常细胞演变为肿瘤细胞，并出现失控性增张[14]。基因的变化导致了细胞层面的变化，但是癌变的细胞形成肿块，离不开细胞间信号传递。在肿瘤的发生发展过程中，外泌体是肿瘤细胞与间质细胞信息交流的重要信使。细胞间的信息交流可以通过直接作用，即细胞因子或膜来源的囊泡进行。有证据[15]表明，细胞外囊泡是细胞间信息交流的重要途径，这些囊泡将具有生物功能的mRNA、micRNA、DNA、蛋白、脂质、代谢产物等从其亲本细胞运输到其他细胞，从而发挥其生物学效应。

2.1 外泌体在上皮细胞-间充质转化(EMT)形成中的作用 EMT是指上皮细胞的特性消失，而具备了间质细胞的表型并具有运动能力，是肿瘤细胞转移前的重要过程。这一过程复杂，包括细胞骨架改变、E-钙黏连蛋白降低等因素[16]。研究发现，几种蛋白、miRNA参与了EMT过程。在此过程中，信号通路被来自细胞外的信号激活，通过调节转录和转录后机制而改变基因的表达。其中，转化生长因子家族的信号传导起着主导作用。Kim等[17]发现，肺腺癌A549细胞自分泌的外泌体诱发了TCF/LEF的转录活性，从而激活了经典的Wnt通路。外泌体携带的miR-23a影响了肺癌A549细胞EMT相关表型的改变。晚期肺癌患者血清中的外泌体波形蛋白表达增加，可使人正常支气管上皮细胞出现EMT。已出现转移的肺癌细胞分泌外泌体，可使肺支气管正常上皮细胞出现增值、侵袭、迁移能力[18]。

2.2 外泌体在间充质干细胞中的作用 实体肿瘤由肿瘤细胞和间质细胞组成，而间质细胞在肿瘤细胞生长、迁移中具有重要作用。肿瘤相关成纤维细胞(TAFs)是一种重要的间质细胞，在多种类型肿瘤的微环境及肿瘤间质的相互作用中具有重要作用。TAF的形成可能包含以下机制，即固有的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，EMT，周细胞，骨髓来源的循环纤维细胞和间质干细胞[19]。Karnoub等[20]发现，肿瘤细胞召集肿瘤干细胞进入其微环境，使其转化为TAFs，从而影响肿瘤生长、血管生成和转移。体外实验证实，肿瘤细胞来源的外泌体能够诱发正常肺成纤维细胞反应，促进脂肪组织的间质干细胞获得肌成纤维细胞的特性，说明肿瘤细胞来源的外泌体具有刺激、辅助肿瘤相关的成纤维细胞获得致癌特性的作用。

在肿瘤微环境中，肿瘤来源的外泌体在肿瘤细胞和间充质干细胞具有通讯功能。Wang等[21]发现，肺癌A549来源的外泌体携带多种lncRNA，刺激间充质干细胞进入活跃状态，提示外泌体携带的lncRNA对间充质干细胞具有重要调节作用，进一步揭示了间充质干细胞与肿瘤细胞之间的通讯机制。肺癌A549来源的外泌体表面具有的热休克蛋白70，可诱发间充质干细胞出现炎症表型，触发了NF-κB通路，使IL-6、IL-8、MCP-1分泌增多，从而提高肺癌的生长能力[22]。

2.3 外泌体在免疫应答中的作用 免疫应答的环境包括：①固有免疫细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、髓系抑制细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞；②获得性免疫细胞，如T和B淋巴细胞。而肿瘤巨噬细胞和T淋巴细胞在肿瘤微环境中更具有代表性。T细胞活化是宿主抗肿瘤免疫过程中的关键步骤。在此过程中，T细胞释放大量外泌体，在免疫细胞和肿瘤细胞内或细胞间的信息交流中具有重要作用。具有生物活性的T细胞可分泌含有FasL的外泌体，诱发T细胞自身凋亡。细胞与免疫系统的交流，依靠外泌体、细胞因子、趋化因子等产物。当肿瘤炎症反应、抗肿瘤免疫发生时，这些调节因子的活性及丰度维持平衡状态。肺癌细胞分泌的外泌体含有的癌基因miR-21和miR-29a可以与小鼠和人类的Toll样受体结合[23]。肿瘤来源CD8和FasL双阳性的外泌体可使MMP9表达增加，提高鼠肺癌3LL细胞的侵袭能力，活化的T细胞外泌体可通过Fas信号通路，增加MMP9表达量，从而提高肺癌细胞的转移能力。白三烯是由免疫细胞产生的一种炎性介质，当细胞受到刺激时，细胞内磷脂酶A2和5-脂氧合酶迁移到核膜，花生四烯酸从核膜磷脂释放，然后产生白三烯A4。白三烯在肺的免疫反应中起重要作用，白三烯D4是半胱氨酰LT1最有力的激动剂，可致支气管收缩和组织重塑。Lukic等收集了单核细胞MM6及肺癌A549细胞培养液中的外泌体，对其中的白三烯进行研究，发现外泌体在细胞间的相互作用是LTD4产生的重要影响因素。Besse等收集了第二代树突细胞来源的外泌体(含有IFN-γ)，应用于化疗后的终末期肺癌患者进行Ⅱ期临床实验，发现这些外泌体应用于晚期非小细胞肺癌患者可加强自然杀伤细胞的抗肿瘤免疫作用。内源性的miRNA-155和miRNA-146a可调节炎症反应，miRNA-155可增加炎症基因表达，而miRNA-146a减少炎症基因表达，从而维持炎症反应的平衡。树突细胞间可依靠外泌体传递miRNA-155和miRNA-146a，参与靶基因的表达，平衡炎症反应，改变细胞对内毒素的反应。

2.4 外泌体在肺癌远处转移中的作用 肿瘤来源的外泌体可以优先与目标细胞融合，形成肿瘤转移的转移前位[2]。在远隔部位创造易于肿瘤生长的微环境，而后再通过外泌体将肿瘤细胞的生物信息运载到已构造的适合肿瘤生长的小环境中，从而形成远处转移灶。肺癌在转移到其他组织器官前，释放了数百万外泌体至循环系统中，却只有少数会“筑巢”-形成转移灶，而“筑巢”的器官并不是随机的。其原因何在？是否有可能因为肿瘤的释放的“侦察兵”外泌体具有一些分子标记，以某种方式引导它们到达特定器官？在肺癌的微环境中，来源于活化T细胞的外泌体可通过Fas/Fasl通路提高肺癌的转移能力。Janowska-Wieczorek等发现，血小板衍生的外泌体可以与肺癌细胞相互作用，增强其转移能力。

作为一个传播者，外泌体可以直接刺激靶细胞膜分子的多种类型或将它传递的内容直接刺激细胞。外泌体表面的整合素不仅仅提高其黏附性，同时也触发目标细胞的信号通路和炎症反应，有利于转移细胞的生长[2]。研究发现，肿瘤来源的外泌体可将小鼠的正常上皮细胞转变为肿瘤细胞。急性髓系白血病细胞来源的外泌体可传递miRNA-155到正常造血干细胞，降低C-Myd的表达，破坏正常的造血干细胞，而促进白血病细胞生长。所有这些均提示，在肿瘤进展过程中，外泌体是细胞间交流的重要信使。

3 外泌体在肺癌诊治中的作用

在肿瘤细胞黏附和内化的外泌体数量是同样大小脂质体的10倍，显示出其较高的癌症靶向治疗特异性。此外，由于增强渗透和滞留效应，纳米外泌体往往易于在含有异常血管形成的肿瘤组织积聚，因此其能轻易达到大的固体肿瘤，从而增加药物输送效率。外泌体可通过其表面受体识别特异细胞，例如具有Tspan8的外泌体优先与CD11b、CD54阳性细胞结合。利用此特点，研究者可设计具有特殊受体的外泌体，更好的与特定细胞结合。外泌体表面糖基化的肽在循环中可耐受蛋白酶的分解，使其更稳定有效的进行靶向传递。基于外泌体这些天然优势，其可作为传递载体应用于癌症治疗，用于传递药物和功能RNA。

目前，有研究证明外泌体可影响肺癌细胞的转移，通过调节外泌体的释放，即可降低肺癌细胞的转移能力。研究通过抑制SNARE家族蛋白YKT6表达，减少了80.9%的外泌体释放，降低了肺癌的转移能力，并且证实miR-134、miR-135b是YKT6的目标miRNA。Xiao等发现，顺铂耐药的肺腺癌A549细胞株分泌的外泌体较敏感株增加，外泌体携带的miR-21、miR-133含量显著升高，将耐药株分泌的外泌体传递给敏感株能显著提高敏感株的耐药性。

肺癌目前尚无特异性高的血清或血浆标记物，低剂量螺旋CT在肺癌筛查中的作用尚存在争议，而外泌体具有双层质膜、不易被分解等特点，可能承载肺癌有效的标记物。microRNA是具有转录后调节功能的小分子，单个microRNA可能通过抑制性复合物与多个mRNA结合，从而阻滞整个生物通路。肿瘤细胞来源的外泌体分泌的microRNA完全不同于正常细胞。外泌体的microRNA具有成为肺癌标志物的优势。Cazzoli等收集了30个血浆样本，通过对742种microRNA进行筛查，发现miR-378a、miR-379、miR-139-5p、miR-200b-5p用于肺癌筛查，miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR200b-5p、miR-629、miR-100、miR-154-3p可用于肺癌的诊断。Munagala等比较了初始肺癌裸鼠与复发裸鼠肿瘤及血清中外泌体的差异miRNA，发现miR-21 和 miR-155在复发肿瘤模型中显著上调，外泌体microRNA将成为一种具有极好前景的无创诊断手段。

综上所述，外泌体获得途径广泛，易于被患者接受，脂质双分子囊泡结构稳定，不易破坏，使其成为蛋白质、核酸、脂质等生物活性物质的良好载体，与肺癌微环境形成，远处转移密切相关。目前针对肺癌来源外泌体的研究仍较少，缺乏对外泌体所携带活性物质的全面分析，外泌体与肺癌肿块内细胞异质性的关系、肺癌微环境中血管形成、肺癌转移至特定器官的机制等问题尚有待进一步研究探索。

[1] Lamparski HG, Metha-Damani A, Yao JY, et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells[J]. J Immunol Methods, 2002,270(2):211-226.

[2] Hoshino A, Costa-Silva B, Shen TL, et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J]. Nature, 2015,527(7578):329-335.

[3] Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes[J]. Nat Biotech, 2011,29(4):341-345.

[4] Bang C, Thum T. Exosomes: new players in cell-cell communication[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012,44(11):2060-2064.

[5] Harshman SW, Canella A, Ciarlariello PD, et al. Characterization of multiple myeloma vesicles by label-free relative quantitation[J]. Proteomics, 2013,13(20):3013-3029.

[6] Gajos-Michniewicz A, Duechler M, Czyz M. MiRNA in melanoma-derived exosomes[J]. Cancer Lett, 2014,347(1):29-37.

[7] Pegtel DM. Oncogenic herpesviruses sending mixed signals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(31):12503-12504.

[8] Record M, Carayon K, Poirot M, et al. Exosomes as new vesicular lipid transporters involved in cell-cell communication and various pathophysiologies[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1841(1):108-120.

[9] Xiang X, Poliakov A, Liu C, et al. Induction of myeloid-derived suppressor cells by tumor exosomes[J]. Int J Cancer, 2009,124(11):2621-2633.

[10] Cao W, Ma Z, Rasenick MM, et al. N-3 poly-unsaturated fatty acids shift estrogen signaling to inhibit human breast cancer cell growth[J]. PLoS One, 2012,7(12):e52838.

[11] Gerlach JQ, Griffin MD. Getting to know the extracellular vesicle glycome[J]. Mol Biosyst, 2016,12(4):1071-1081.

[12] Escrevente C, Grammel N, Kandzia S, et al. Sialoglycoproteins and N-glycans from secreted exosomes of ovarian carcinoma cells[J]. PLoS One, 2013,8(10):e78631.

[13] Pocsfalvi G, Stanly C, Fiume I, et al. Chromatography and its hyphenation to mass spectrometry for extracellular vesicle analysis[J]. J Chromatogr A, 2016,1439:26-41.

[14] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011,144(5):646-674.

[15] Fujita Y, Yoshioka Y, Ochiya T. Extracellular vesicle transfer of cancer pathogenic components[J]. Cancer Sci, 2016,107(4):385-390.

[16] Ramteke A, Ting H, Agarwal C, et al. Exosomes secreted under hypoxia enhance invasiveness and stemness of prostate cancer cells by targeting adherens junction molecules[J]. Mol Carcinog, 2015,54(7):554-565.

[17] Kim J, Kim TY, Lee MS, et al. Exosome cargo reflects TGF-beta1-mediated epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) status in A549 human lung adenocarcinoma cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,478(2):643-648.

[18] Rahman MA, Barger JF, Lovat F, et al. Lung cancer exosomes as drivers of epithelial mesenchymal transition[J]. Oncotarget, 2016,7(34):54852-54866.

[19] Otranto M, Sarrazy V, Bonte F, et al. The role of the myofibroblast in tumor stroma remodeling[J]. Cell Adh Migr, 2012,6(3):203-219.

[20] Karnoub AE, Dash AB, Vo AP, et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J]. Nature, 2007,449(7162):557-563.

[21] Wang S, Li X, Zhu R, et al. Lung cancer exosomes initiate global long non-coding RNA changes in mesenchymal stem cells[J]. Int J Oncol, 2016,48(2):681-689.

[22] Li X, Wang S, Zhu R, et al. Lung tumor exosomes induce a pro-inflammatory phenotype in mesenchymal stem cells via NFkappaB-TLR signaling pathway[J]. J Hematol Oncol, 2016,9:42.

[23] Kucharzewska P, Christianson HC, Welch JE, et al. Exosomes reflect the hypoxic status of glioma cells and mediate hypoxia-dependent activation of vascular cells during tumor development[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(18):7312-7317.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.035

R734.2

A

1002-266X(2017)47-0110-04

河北省级科技项目(2015043463)。

陈刚(E-mail: chengang.8@hotmail.com)

2017-10-13)