颗粒链球菌属鉴定方法及临床感染的研究进展

吴玲玲，田玉静，李 震，桑颜颜，姜梅杰，赵书平

颗粒链球菌属是人类口腔、泌尿生殖道和肠道内的正常菌群，Frenkel和 Hirsch［1］于 1961 年首次在感染性心内膜炎和中耳炎患者的血培养中分离得到，由于他们特殊的生长要求及围绕其他细菌生长的卫星现象，定义为营养变异链球菌（nutritionally variant streptococci，NVS）。2000 年，Collins等［2］应用16S rRNA基因序列研究，将NVS分为颗粒链球菌属和乏氧菌属，其中乏氧菌属由软弱乏氧菌1个菌种组成。颗粒链球菌属包含毗邻颗粒链球菌（Granulicatella adiacens）、副毗邻乏养球菌（Granulicatella para-adiacens）、细长颗粒链球菌（Granulicatella elegans）和貂鲸颗粒链球菌（Granulicatella balaenopterae）。

1 培养及生化特征

颗粒链球菌属为无动力、无芽孢，兼性厌氧，触酶和氧化酶阴性的革兰阳性球菌。但在缺乏营养的条件下，则显示出多形性，如球菌、球杆菌及杆菌等。10℃和45℃不生长，在6.5%NaCl肉汤中不生长，对营养要求较高，在血平板中加入0.01%L-半胱氨酸或0.001%盐酸吡哆醛可形成针尖样大小，灰白色菌落，对奥普托欣耐药，对万古霉素敏感。PYR阳性，碱性磷酸酶阴性，不水解精氨酸和马尿酸盐，不发酵核糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、棉子糖。

2 鉴定方法

对乏养球菌和颗粒链球菌与相关菌的鉴定通常较为困难。这是因为此类菌在培养链球菌的常用培养基上生长不良，以及这些细菌的形态多形性、染色可变性及生化特性的非典型性等。目前的鉴定方法如下。

2.1 卫星试验 一般认为“吡哆醛依赖试验”和“卫星现象”是关键的手工鉴定方法。毗邻颗粒链球菌在普通血平板上不上长，在金黄色葡萄球菌周围呈现卫星现象生长，是一种典型的共生菌。其他可产生卫星现象的细菌有类白喉，葡萄球菌属，链球菌属，革兰阴性菌和酵母菌，这些细菌可以提供其生长需要的盐酸吡哆醛。KOH等［3］的研究表明不同厂家生产的血平板由于所含营养物质的不同而出现不一样的卫星现象，毗邻颗粒链球菌在有些血平板上不出现卫星现象。卫星试验结合VITEK 2 Compact系统的GP板条可以鉴定到种。

2.2 16S r RNA基因测序分析 16S rRNA基因为细菌所保守序列及可变序列，后者是细菌种属鉴定的分子基础。Yuko等［4］发现16S rRNA基因的PCR扩增可以作为检测颗粒链球菌的常规检测方法。国内报道［5］用16S rRNA基因测序法鉴定出1株毗邻颗粒链球菌，该菌从1例无肌性皮肌炎患者皮疹溃疡处分离得到。多项研究表明此方法可以作为具有高效、准确、特异性强等优点。

2.3 MALDI-TOF MS飞行时间质谱法 飞行质谱是近年来兴起的一种用于细菌快速鉴定的基于蛋白质组学的新技术，已广泛用于临床微生物的快速检测。多项研究显示，质谱法对乏养球菌和颗粒链球菌鉴定较准确。

2.4 groESL groES和groEL是细菌广泛存在并且进化中高度保守的基因［6］，也被称作cpn10/60或hsp10/60，编码10 kDa和60 kDa的热休克蛋白，当细菌暴露在高温或其他胁迫条件下，这些蛋白负责变性蛋白的重新折叠。Hung等［7］应用多重PCR方法对groESL进行扩增，快速地将试验的标准菌株乏养球菌，颗粒链球菌和孪生球菌鉴定到属。

3 颗粒链球菌与感染

随着研究进一步深入，颗粒链球菌属所导致的感染日益引起人们的重视。越来越多的研究表明他们与多种疾病相关。

3.1 感染性心内膜炎 颗粒链球菌引起的感染，虽然不常见（4.3%～6%），却可以导致严重的发病率和致死率，其临床过程比其他链球菌更为严重，抗生素治疗需要持续的时间更长。文献统计高达61%的与心内膜炎相关的瓣膜性心脏病是由颗粒链球菌属引起的，比如先天性心脏病或心脏瓣膜修复术。颗粒链球菌属引起感染性心内膜炎的机制尚不清楚，这些细菌被认为起源于口腔龋齿［8，9］，在过去的几个月内患者有牙科操作而又没有良好的口腔护理卫生导致了感染性心内膜炎的发生。另外，先前存在的心脏病也是颗粒链球菌感染的高危因素。及早分离这些细菌以及联合瓣膜置换手术可以减少感染性心内膜炎的病死率。

3.2 新生儿败血症 Bizzarro等［10］报道一位新生儿肺炎的血培养中分离经生化及16S rRNA扩增证明是毗邻颗粒链球菌，并从其母亲的子宫颈口分泌物中分离得到同样的细菌，可能是通过母婴传播感染新生儿，可能是除B群链球菌外导致产妇和新生儿感染的另一重要细菌。应用万古霉素联合庆大霉素治疗后患者好转出院。

3.3 脊椎骨髓炎 York等［11］报道毗邻颗粒链球菌引发的脊椎骨髓炎，经万古霉素和头孢他啶治疗联合手术治疗后患者好转。目前，文献报道的毗邻颗粒链球菌引起脊椎骨髓炎的感染只有4例。

3.4 髋关节假体感染 Renz等［12］报道1例副毗邻颗粒链球菌导致髋关节假体感染的病例，患者表现为发烧和活动后髋关节的疼痛。对患者关节积液的进行培养，经生化试验和16S rRNA基因测序鉴定致病菌是副毗邻颗粒链球菌，查体结合患者的病史认为牙根脓肿引起的血流感染是髋关节假体感染的主要原因，突出了关节成形术前治疗牙周炎和关节成形术后为预防血流感染保持正确口腔卫生的重要性。

3.5 急性脑膜炎 国内报道［13］毗邻链球菌引起脑膜炎的病例。对患者脑脊液增菌培养，经VITEK全自动生化系统鉴定是毗邻链球菌感染，应用头孢曲松治疗后患者情况好转，脑脊液常规及生化正常，脑脊液再次培养阴性。

另有文献［14，15］报道颗粒链球菌还可以引起胰腺囊肿，眼内炎，结膜炎和产后败血症等。国内也有报道［16］玻璃体中分离出1株毗邻颗粒链球菌。

4 药敏试验

CLS推荐微量肉汤稀释法，使用阳离子调节Mueller-Hinton肉汤，补充2%～5%溶解马血和0.001%盐酸吡哆醛。在这些条件下，大约55%的毗邻颗粒链球菌对青霉素敏感，63%对头孢曲松敏感，96%对美罗培南敏感，100%对万古霉素敏感。青霉素联合庆大霉素是通常推荐的治疗方案，对青霉素过敏或治疗失败患者，可单用万古霉素或万古霉素联合庆大霉素或利福平治疗。

总之，目前有关颗粒链球菌属感染病例的报道日益增多，表型鉴定的低检出率和耗时过长也增加了诊断及治疗的难度。血培养阳性经革兰染色呈短链或成对状的阳性球菌，在血平板上不生长或生长缓慢，微生物工作者应考虑可能是颗粒链球菌，可以加做卫星试验，有条件的实验室可以应用16S rRNA基因测序技术辅助鉴定。在血平板中加入盐酸吡哆醛可以促进这些细菌的生长，虽然颗粒链球菌的耐药性逐渐增加，但青霉素联合庆大霉素仍然是通常推荐的治疗方法。对于临床微生物检验工作者而言，尽早地检出颗粒链球菌将有助于临床及时诊断和治疗。

参考文献

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