熊果酸对大鼠血管外膜成纤维细胞增殖的影响

刘盛华　刘小利　李彬　邹增晓

【摘要】 目的：研究采用MTT法检测不同浓度的熊果酸对大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞增殖的影响。方法：解剖分离SD大鼠的胸主动脉，获取胸主动脉血管外膜。对血管外膜成纤维细胞进行培养、纯化、传代。采用TGF-β1诱导血管成纤维细胞增殖，用不同浓度的熊果酸抑制细胞增殖，用MTT法检测不同浓度的熊果酸对TGF-β1诱导血管外膜成纤维细胞增殖的影响。结果：随着熊果酸浓度的增加，UA组的OD值逐渐减小，血管外膜成纤维细胞的抑制率逐渐增加，且各组UA细胞抑制率比较，差异均有统计学意义（P<0.05），UA3组（UA浓度45 μmol/L）的细胞抑制率作用最强。结论：熊果酸对TGF-β1介导的胸主动脉外膜成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用，该抑制作用随着熊果酸的浓度增加而增强。

【关键词】 熊果酸； 血管外膜成纤维细胞； 增殖； 再狭窄

Effect of Ursolic Acid on the Proliferation of Adventitial Fibroblasts in Rats/LIU Sheng-hua，LIU Xiao-li，LI Bin，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（06）：006-009

【Abstract】 Objective：To study the effects of different concentrations of ursolic acid on the proliferation of rat thoracic aorta adventitial fibroblasts by MTT assay.Method：The thoracic aorta of SD rats were dissected，and the adventitia of thoracic aorta was isolated.The adventitial fibroblasts were cultured，purified and passaged.TGF-β1 was used to induce the proliferation of vascular fibroblasts，different concentrations of ursolic acid were used to inhibit cell proliferation，MTT method was used to detect the effect of ursolic acid on the proliferation of vascular adventitial fibroblasts induced by TGF-β1.Result：With the increase of ursolic acid concentration，the OD of UA group decreased gradually，the inhibitory rate of adventitial fibroblasts was gradually increased，and the inhibitory rate of UA cells in each group were statistically significant（P<0.05），UA3 group （UA concentration 45 μmol/L） had the strongest inhibitory effect.Conclusion：Ursolic acid significantly inhibit TGF-β1 mediated proliferation of adventitial fibroblasts of thoracic aorta，the inhibitory effect is enhanced with the increase of ursolic acid concentration.

【Key words】 Ursolic acid； Vascular adventitial fibroblast； Proliferation； Restenosis

First-authors address：Guangdong Provincial Corps Hospital of Chinese Peoples Armed Police Forces，Guangzhou 510000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.06.002

冠狀动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft，CABG）是冠心病患者冠状动脉再血管化的重要方法，桥血管的通畅率是评价其治疗效果最重要的指标。无论是动脉桥还是静脉桥，再狭窄都与手术操作所带来的损伤及局部的炎性反应有着重要的关系。术后桥血管内膜、中膜和外膜的增生导致血管重塑是再狭窄的病理学基础。对于行CABG手术患者的桥血管，术中难免会有一定程度的损伤，在血管损伤后，位于血管外膜的成纤维细胞由“静止”状态转为“激活”状态，并迁徙至内膜下区域和新生内膜中并增殖[1-2]。本研究采用转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞增殖，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度的熊果酸对成纤维细胞增殖的影响，为熊果酸治疗冠状动脉旁路移植术后桥血管再狭窄提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 120 g左右的SD大鼠，购自南方医科大学实验动物中心。熊果酸、PBS液、ELISA试剂盒和戊巴比妥钠购自上海逸术生物科技有限公司。TGF-β1为GenWay Biotech公司产品，MTT、Vimentin抗体、α-SMA抗体和desmin抗体均由武汉赛维尔生物科技有限公司提供。

1.2 大鼠血管外膜成纤维细胞的原代培养 取120 g左右的SD大鼠，腹腔注射0.25%戊巴比妥那40 mg/kg麻醉，颈部脱臼处死，碘伏消毒，解剖取出胸主动脉。PBS液冲洗胸主动脉，将胸主动脉在显微镜下分离外膜，再用PBS液冲洗。将胸主动脉外膜剪成1 mm×1 mm大小的组织块，将其贴于培养瓶底部，放入培养箱中孵育6～8 d。

1.3 大鼠血管外膜成纤维细胞的传代 待单层细胞长至铺满瓶底80%以上时进行细胞传代。细胞传代后，24 h后可见细胞重新贴壁生长，将其再传代。成纤维细胞传至4～8代后，即可用于细胞实验。

1.4 血管外膜成纤维细胞的纯化 血管外膜经过几代生长后，成纤维细胞利用较快的生长速度达到自然纯化，得到较高纯度的成纤维细胞。

1.5 血管外膜成纤维细胞的鉴定 采用细胞免疫荧光技术，利用Vimentin抗体和α-SMA抗体及desmin抗体鉴定细胞。Vimentin抗体阳性同时α-SMA和desmin抗体阴性，便说明为外膜成纤维细胞。

1.6 细胞的冻存 传代后的细胞融合至80%后进行冻存。离心搜集细胞，将其放入-80 ℃冰箱中保存。

1.7 细胞的复苏 冻存管放入37 ℃融化，将其放入培养瓶中，再放入孵箱中。

1.8 对血管外膜成纤维细胞增殖能力影响的检测

1.8.1 细胞实验分组 空白对照组：单纯细胞孔，不作任何干预；TGF对照组：每个细胞孔中加入（TGF-β1 10μg/L）；UA1组：每个细胞孔中加入（TGF-β1 10 μg/L+UA 15 μmol/L）；UA2组：每个细胞孔中加入（TGF-β1 10 μg/L+UA 30 μmol/L）；UA3组：每个细胞孔中加入（TGF-β1 10 μg/L+UA 45 μmol/L）。每组以6个标本计算OD平均值。

1.8.2 MTT法检测缓释药膜对血管外膜成纤维细胞活力的影响 成纤维细胞以每孔6×105个细胞接种于96孔板。培养后加入各组试剂，2 d后弃培养基，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）0.02 mL。经孵育4 h在490 nm波长下用酶联免疫仪测定吸光值（OD值）。根据以下公式计算成纤维细胞的增值率和抑制率。TGF细胞增值率（%）=（TGF对照组MTT OD值-空白对照组MTT OD值）/空白对照组MTT OD值×100%。UA细胞抑制率（%）=（TGF对照组MTT OD值-UA组MTT OD值）/TGF对照组MTT OD值×100%。

1.9 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析数据，计量资料数据采用均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用t检验，两组以上比较采用析因设计的方差分析；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，两组以上比较采用析因设计的方差分析，取α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

空白对照组的OD值为（0.52±0.04），与TGF对照组的（0.76±0.09）比较，差异有统计学意义（P<0.05），TGF细胞增值率为46.1%。各组血管外膜成纤维细胞MTT的OD值和细胞抑制率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。UA1组、UA2组、UA3组的OD值和细胞抑制率分别为（0.71±0.03）、（0.65±0.06）、（0.57±0.05）和6.5%、14.4%、25.0%，随着熊果酸浓度的增加，UA组的OD值逐渐减小，血管外膜成纤维细胞的抑制率逐渐增加，差异均有统计学意义（P<0.05），UA3组（UA浓度45 μmol/L）的细胞抑制率作用最强。

3 讨论

尽管临床上大多数冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者会选择经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）作为首选治疗方法，但冠状动脉旁路移植术仍然是冠状动脉血运重建最重要的外科方法，尤其是对PCI失败或PCI术后再狭窄的患者[3-4]。对于冠状动脉再血管化的方法，桥血管的通畅率是评价其治疗效果最重要的指标[5]。术后桥血管内膜、中膜和外膜的增生导致血管重塑是再狭窄的病理学基础。因此，成纤维细胞的增殖转化在血管重构的发生发展中扮演着重要的角色。在血管再狭窄的重塑中，血管外膜成纤维细胞（vascular adventitial fibroblast，VAF）在以往的研究中往往被认为只起着支持和营养的作用。越来越多的研究表面，血管外膜成纤维细胞的增殖和迁徙在血管重塑的机制中起着重要的作用[6-7]。当血管发生损伤性病变，如血管张力增加、内皮细胞损伤、高血脂或外膜剥离等，血管外膜成纤维细胞会发生凋亡、增殖，在损伤血管局部释放血小板衍生因子和TGF-β1等因子的诱导下血管外膜成纤维细胞会发生表型的改变，同时细胞会表达α-SMA，血管外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化进而引起组织的修复与病变血管的重塑[8]。研究表明在局部发生炎症时，血管外膜成纤维细胞的表型改变、细胞增生以及迁徙并释放细胞外基质并形成新的外膜。同时，血管外膜成纤维细胞会分泌高于正常水平的MMPs，该酶能降解细胞外基质，并促进局部细胞的迁徙[9]。血管外膜主要含有血管外膜成纤维细胞、脂肪细胞和胶原组织。血管外膜成纤维细胞作为多种炎性细胞因子所作用的靶细胞，同时也能分泌相关的免疫调节因子参与部分细胞生长的调节过程。研究熊果酸是否具有抑制血管外膜成纤维细胞增殖的影响，可以对血管外膜成纤维细胞的迁徙、增殖、胶原合成与分泌及细胞表型转化为重要病理学基础所导致的血管再狭窄的治疗提供重要的实验依据。

熊果酸广泛存在于自然界中，分子式为C30H48O3，又名乌索酸、乌苏酸。其为脂溶性物质，易溶于甲醇、吡啶等物质，可透过细胞膜发挥药理作用，具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等较为广泛的生物学作用[10-12]，目前已广泛用于化妆品及医药行业。研究表明，熊果酸能够较强地抑制体外培养增殖期的血管内皮细胞的血管形成，其抑制程度与熊果断的浓度呈正相关[13]。熊果酸具有抑制NF-κB所介导的炎症反应所导致的细胞增生、氧化、细胞凋亡的作用[14]。文献[15]研究表明，熊果酸可能通过抑制炎症反应的中心物质NF-κB的活化，进而抑制MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的表达。总之，熊果酸可以抑制术后静脉桥血管的狭窄[16]。熊果酸抑制术后静脉桥血管再狭窄的是由抑制局部炎症，诱导细胞凋亡等多种因素作用的结果。目前对于熊果酸诱导细胞凋亡的作用多集中在抑制肿瘤细胞上[17]。研究表明，熊果酸具有诱导肺癌细胞PGCL3细胞的凋亡，抑制此类细胞株运动、侵袭和粘附的作用[18]。Baek等[19]研究证实，熊果酸能显著抑制人白血病细胞HL-60的增殖，诱导其凋亡，该作用具有明显的浓度依赖性。TGF-β具有能使在琼脂中生长的成纤维细胞发生表型的转化，从而起到促使细胞生长和分化、增殖的作用。研究表明，TGF-β1可促進血管外膜成纤维细胞的增殖，并且具有明显的剂量依赖关系。10 μg/L TGF-β1促进增殖作用最为明显[20]。

本研究表明，熊果酸对TGF-β1介导的大鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用，该抑制作用随着熊果酸的浓度增加而增强。因此熊果酸不但具有抑制血管内膜、中膜细胞增殖的作用，也具有抑制血管外膜成纤维细胞增殖的作用。本研究完善了熊果酸抑制血管再狭窄的机制，可以为熊果酸抑制冠状动脉旁路移植术后桥血管再狭窄提供实验依据。

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（收稿日期：2017-01-20） （本文编辑：张爽）