香豆素类化合物的抗菌活性及其作用机制研究进展

罗礼阳，罗晓星，李明凯

(第四军医大学药学院，西安710032)

香豆素类化合物的抗菌活性及其作用机制研究进展

罗礼阳，罗晓星，李明凯

(第四军医大学药学院，西安710032)

香豆素类化合物是一类含苯骈α-吡喃酮结构的芳香含氧杂环化合物，广泛存在于植物和微生物的代谢产物中，具有抗菌、抗病毒、抗凝血等生物活性。目前，对香豆素类化合物抗菌活性的研究广泛且成绩斐然。天然香豆素类化合物由于衍生物种类繁多，其抗菌活性亦不尽相同。目前认为，香豆素类化合物的抗菌机制与细菌DNA解旋酶、群体感应系统、青霉素结合蛋白等有关。

香豆素类化合物；抗菌活性；DNA解旋酶；细菌群体感应系统

目前，世界范围内细菌耐药已呈现多药耐药趋势，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等超级细菌的出现。人类一旦感染这类细菌，可能会面临无药可用的境地。天然产物骨架的复杂性和丰富的官能团化赋予了天然产物类化合物独有的生物活性。香豆素类化合物是一类含苯骈α吡喃酮结构的芳香含氧杂环化合物，在结构上可以看作为顺式邻羟基桂皮酸脱水而形成的内酯类化合物。香豆素类化合物广泛分布于茄科、芸香科、伞形科等植物中，如蛇床子、独活、白芷。近年来从动物及微生物的代谢产物中发现了一些新的香豆素类化合物，如发光真菌中的亮菌素类、海洋真菌Hansfordiasinuosae中的异香豆素以及中药僵蚕中的香豆素等[1～3]。迄今为止，已从自然界中分离了1 300余种香豆素类化合物。香豆素类化合物具有抗菌、抗病毒、抗凝血等生物活性[4～7]，尤其是其抗菌活性已被研究证实。香豆霉素A、氯香豆霉素等香豆素类抗生素已在临床用于肺炎、败血症等疾病的治疗。本课题组对香豆素类化合物进行结构改造和修饰，优选出了若干对多药耐药细菌抗菌活性强的化合物，并结合文献对其抗菌活性及其机制进行综述。

1 香豆素类化合物的结构、分类及其抗菌活性

根据α吡喃酮环上有无取代，7-羟基是否和C6、C8位异戊烯基成环(呋喃环、吡喃环)，可将香豆素类化合物分为四类：简单香豆素类、呋喃香豆素类、吡喃香豆素类和其他香豆素类。香豆素类化合物均具有一定的抗菌活性，由于其化学结构不同，其抗菌活性亦有区别。香豆素类化合物的抗菌活性和构效关系比较复杂，目前尚不完全清楚。本文主要阐述前三类香豆素类化合物的结构及抗菌活性。

1.1 简单香豆素类化合物 简单香豆素类化合物只在香豆素苯环一侧有取代基， 如羟基、甲氧基等，取代基主要位于C7位、C6位或C8位，且未形成呋喃环或吡喃环。这类化合物主要存在于伞形科植物中的伞形花内酯和白花前胡醇、茵陈中的滨蒿内酯、独活中的当归内酯、瑞香中的瑞香素、蛇床子中的蛇床子素、秦皮中的秦皮乙素和秦皮素、 橙皮中的橙皮油素以及东莨菪素等。

香豆素类化合物本身抗菌活性相对较低，但当其母核上引入某些取代基后，其抗菌活性显著增强。如含有长链取代基的香豆素类化合物欧前胡素和阿莫树脂醇对巨大芽孢杆菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性明显增强。Maracic等[8]研究发现，在简单香豆素类化合物的化学结构上加入含有三氮唑的支链取代基后，可展现出优良的抗卡他莫拉菌活性，其抗菌效果优于阿奇霉素，最低抑菌浓度(MIC)≤0.25 μg/mL。Canning等[9]研究还发现，非洲传统药物曼密树皮甲醇粗提物纯化后的化合物曼密A/AA具有良好的抗菌活性，对空肠弯曲杆菌、肺炎链球菌和艰难梭状芽孢杆菌的MIC分别为0.5、0.25、0.25 μg/mL。飞龙掌血在印度民间一直被用来治疗咳嗽、风湿、消化不良等。Karunai Raj等[10]从飞龙掌血根中提取、分离出白花前胡醇，并发现其对铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌等具有不同程度的抗菌活性。

1.2 呋喃香豆素类化合物 香豆素母核上的异戊烯基与邻位酚羟基(7-羟基)缩合形成呋喃环，同时降解失去3个碳原子而形成的一系列化合物。如7位羟基或6位异戊烯基形成呋喃环时，结构中的呋喃环、苯环、α吡喃酮环同处于一条直线上，即为线型呋喃香豆素类化合物；若7位羟基与8位碳上异戊烯基形成呋喃环时，结构中的呋喃环、苯环和α吡喃酮环则在一条折线上，即为角型呋喃香豆素类化合物。呋喃香豆素类化合物在自然界中主要存在于伞形科植物中。如紫花前胡中的紫花前胡内酯、补骨脂中的补骨脂素等，属于线形呋喃香豆素类化合物；牛尾独活中的异佛手柑内酯、白芷素植物中的比克白芷素、紫花前胡中的紫花前胡苷等，属于角型吠喃香豆素类化合物。

从植物中提取、分离的线型或角型呋喃香豆素类化合物均有一定抗菌活性。有研究发现，欧前胡素对大肠埃希菌(ATCC10875)、金黄色葡萄球菌(ATCC13709)等标准菌株有一定抗菌活性。Tada等[11]从伞形科植物Prangospabularia分离出氧化前胡素、欧前胡素、蛇床子素三种呋喃香豆素类化合物，并发现其对敏感金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均表现出一定抗菌活性。Verotta等[12]从藤黄科植物铁力木的花中分离了多种4-烷基、4-苯基、5，7-二羟基香豆素类化合物，并发现其对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌等均具有一定抗菌活性，MIC为4～8 μg/mL。

1.3 吡喃香豆素类化合物 与呋喃香豆素类化合物相似，7位羟基与6位或8位取代基——异戊烯基缩合形成吡喃环。如7位羟基与6位异戊烯基形成吡喃环时，化学结构中的吡喃环、苯环和α吡喃酮环处在一条直线上，即为线型吡喃香豆素类化合物，如美花椒内酯；若7位羟基与8位异戊烯基形成吡喃环时，化学结构中的吡喃环、苯环和α吡喃酮环处在一条折线上，即为角型吡喃香豆素类化合物，如白花前胡苷和北美芹素。常见的吡喃香豆素类化合物还有狭缝芹中的狭缝芹素、紫花前胡素以及白花前胡中的北美芹素、白花前胡丙素、白花前胡苷Ⅱ等。

目前对天然吡喃香豆素类化合物抗菌活性的研究相对较少。吡喃香豆素类化合物对结核杆菌具有一定抗菌活性。Xu等[13]研究发现，吡喃香豆素类化合物calanolide A对结核杆菌的药敏株和耐药株均有一定抗菌活性。此外，Basile等[14]从伞形花科类植物Ferulagocampestris的根中分离并鉴定了含量最丰富的三种吡喃香豆素类化合物，结果发现agasyllin及其水解产物aegelinol对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌的抗菌活性较好。

2 香豆素类化合物的抗菌作用靶点

以往认为，香豆素类化合物的抗菌活性主要与细菌DNA回旋酶有关。目前认为，香豆素类化合物的抗菌活性还与群体感应系统、青霉素结合蛋白等有关。

2.1 竞争性抑制回旋酶的ATP酶活性 细菌回旋酶是细菌特有的一种酶，属于拓扑异构酶Ⅱ，是由A亚基(GyrA)和B亚基(GyrB)组成的异二聚体，分别由GyrA和GyrB基因编码。GyrB能与ATP结合水解ATP，GyrA利用ATP水解的能量将共价闭合环状DNA转变为负超螺旋DNA，从而维持细菌体内正常的超螺旋结构。关于香豆素类化合物对细菌回旋酶的作用最早见于新生霉素抗菌机制的研究。新生霉素能与ATP竞争性地结合到回旋酶的B亚基，从而使DNA回旋酶失去能量来源而失活。之后有研究发现，香豆素类化合物与DNA回旋酶的结合位点是在GyrB的N端，新生霉素的结合位点和ATP的结合位点有部分重叠，其中新生霉素的维诺糖部分和ATP的腺嘌呤环与DNA回旋酶的相互作用方式相似。表明香豆素类化合物并非简单地作为回旋酶的竞争性抑制剂，其结合后可使酶的构象和ATP亲和力降低，从而抑制回旋酶的活性[15]。但目前该过程的精确调控模式尚不完全清楚。

新生霉素在临床使用中易产生耐药性，对其耐药机制的研究发现，耐药细菌具有高度抗性的突变主要发生在回旋酶的GyrB上，特别是Arg-136位点，但对酶的活性影响并不明显。表明Arg-136残基在新生霉素与回旋酶结合过程中具有重要作用。进一步研究发现，该位点的突变对香豆素类抗菌药物库马霉素的耐药程度较低。提示不同香豆素类化合物与回旋酶的结合模式并不相同，这可能是由于香豆素类化合物酰基、脱氧糖基和氨基香豆素基团等主要药效基团之间的差异所致[16]。

目前普遍认为，喹诺酮类化合物主要是抑制DNA-酶复合物的形成，香豆素类化合物主要是抑制ATP水解和超螺旋反应的偶联。但Flatman等[17]研究发现，香豆素类化合物Simocyclinone D8(SD8)虽然含有和新生霉素、香豆霉素等相同的关键特征氨基香豆素基团，但SD8和已知的氨基香豆素类和喹诺酮类的机制均不同，主要通过阻止DNA回旋酶与DNA结合的早期步骤来发挥抗菌作用。提示不同取代基对香豆素类化合物与回旋酶的结合模式有着重要影响。进一步研究发现，香豆霉素A和氯香豆霉素等经典的氨基香豆素类抗菌药物以及多种香豆素类化合物与细菌回旋酶均有极高的亲和力，可作用于回旋酶抑制细菌DNA的复制。如Wang等[18]研究发现，秦皮素会增加细胞膜的通透性，能够阻断DNA回旋酶与DNA的结合来干扰核酸和蛋白的合成。

2.2 抑制群体感应系统 细菌群体感应系统是细菌间信息传递的重要机制，细菌通过合成、分泌自诱导分子(AI)来控制整个细菌群体行为。当胞外AI浓度达到一个临界浓度时，AI能启动细菌体内相关基因的表达，调控细菌产生毒素、形成生物膜等生物学行为，使细菌适应环境的变化。革兰阴性细菌和阳性细菌的AI有所不同。革兰阴性菌常利用高丝氨酸内酯类物质(AHL)作为AI信号分子，而革兰阳性菌则多利用小分子多肽(AIP)作为AI信号分子。另外，在革兰阴性菌与革兰阳性菌均存在一种自诱导物质，其化学结构是呋喃酮酰硼酸二酯[19，20]。

目前，人们已把寻找细菌群体感应系统拮抗药物聚焦到植物。在具有抗菌活性的天然药物库中，Lee等[21]评价了9种香豆素类化合物对大肠埃希菌O157：H7的抗菌活性，发现伞形酮能够抑制细菌生物膜形成80%以上，而不影响细菌生长；进一步研究发现，该类香豆素类化合物能抑制细菌curli菌毛基因和运动基因的转录，这与观察到的鞭毛数量减少、泳动减弱以及生物膜形成减少等现象一致。有研究亦发现，呋喃酮衍生物可作为铜绿假单胞菌的群体感应系统信号拮抗剂，被呋喃酮衍生物所抑制的基因中约80%为群体感应系统所调节，包括编码多药外排泵和毒力因子等基因。在瑞香素、七叶亭、花椒毒酚和伞形花内酯对青枯雷尔菌抗菌活性研究中发现，这些化合物均能抑制青枯雷尔菌增殖；透射电子显微镜和荧光显微镜下可见，该类化合物可破坏病原体的细胞膜，抑制生物膜的形成[22]。在铜绿假单胞菌中，天然香豆素类化合物可拮抗不同长度的AHL对细菌群体感应系统的激活，抑制关键毒力因子的释放和生物膜的形成[23]。香豆素类化合物可通过抑制细菌群体感应系统，减少相关毒力因子的表达和生物膜的形成，从而降低细菌的致病性和耐药性。随着人们对香豆素类化合物作为群体感应系统拮抗剂研究的逐步深入，该类化合物有可能成为一种新型抗菌药物。

3.3 其他机制 由于香豆素类化合物化学结构多样，其抗菌谱和抗菌活性差异较大。对香豆素类化合物抗菌靶点的研究除了细菌DNA回旋酶和群体感应系统外，还发现存在其他的抗菌机制，这可能与香豆素类化合物化学结构的多样性有关，也可能与细菌种类有关。de Araujo等[24]研究发现，香豆素类化合物与四环素或氟哌酸合用后可使四环素或氟哌酸抗MRSA的MIC降低50.0%～87.5%。香豆素的非极性基团是发挥协同抗菌作用的重要因素，当香豆素类化合物与MRSA青霉素结合蛋白(PBP)分子对接时，所需结合能量较低，推测该类化合物是PBP的强效抑制剂。我们近期研究发现，4-羟基香豆素化合物对MRSA和表皮葡萄球菌等均有较好的抗菌活性，其中香豆素环上的羟基对抗菌活性非常重要[25]；扫描电镜和透射电镜下发现，该类化合物基本不影响细菌的正常形态，但可明显抑制细菌拟核区遗传物质的合成；体外研究发现，其抗菌活性可能与抑制细菌DNA聚合酶功能有关。在大肠埃希菌中，参与应急反应的蛋白RecA通过刺激LexA的分解，诱导四十多种基因表达的SOS调控系统，而香豆素类化合物能通过阻遏氟喹诺酮类药物诱导激活的RecA来降低耐药的产生[26]。Lama等[27]利用香豆素类化合物amicoumacin A处理MRSA后，发现其能使MRSA的细胞膜能量耗散，而MRSA会通过减少蛋白合成、DNA扩增等胞内代谢代偿性地改变来应对细胞膜的功能紊乱，从而增加其存活率。

综上所述，天然香豆素类化合物由于其衍生物种类繁多，其抗菌活性和机制亦不尽相同。深入研究香豆素类化合物的作用靶点和抗菌机制，将为耐药菌感染治疗提供了一种新策略，亦为抗菌药物研制提供了一个新方向。

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国家自然科学基金资助项目(81573468)；陕西省科技统筹创新工程(2014KTCL03- 03)。

李明凯(E-mail： mingkai@fmmu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.033

R285.6

A

1002- 266X(2017)28- 0102- 04

2016-10- 08)