大黄含药血清对乳鼠原代肝细胞能量代谢的影响

阚东方，季旭明，陈倩，2，韩晓春，武继彪

(1山东中医药大学中医学院，济南250355；2山东医药技师学院)

大黄含药血清对乳鼠原代肝细胞能量代谢的影响

阚东方1，季旭明1，陈倩1，2，韩晓春1，武继彪1

(1山东中医药大学中医学院，济南250355；2山东医药技师学院)

目的探讨大黄含药血清对乳鼠原代肝细胞能量代谢的影响。方法制备大黄含药血清；以胶原酶消化法获取乳鼠原代肝细胞，将细胞随机分为空白血清组、含药血清组，分别用20%空白血清培养液、20%大黄含药血清培养液干预24 h。采用生化法检测细胞内三磷酸腺苷(ATP)酶活性，高效液相色谱法检测细胞内ATP含量及细胞能荷，罗丹明123荧光染色法检测细胞线粒体膜电位。结果与空白血清组比较，含药血清组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性低(P均<0.05)，ATP含量低(P<0.05)，两组能荷比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白血清组比较，含药血清组细胞线粒体膜电位低(P<0.05)。结论大黄含药血清可能通过调整乳鼠原代肝细胞线粒体功能来抑制其能量代谢，降低其能量储备。

肝细胞；能量代谢；大黄含药血清；中药；大鼠

大黄味苦、性寒，有泻热通肠、凉血解毒等功效，广泛应用于热证的治疗。现代研究表明，中药的寒热药性与能量代谢密切相关[1]。本课题组前期有关能量代谢的研究主要集中于动物体内实验，涉及寒热性中药对体温、耗氧量、超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶等基础指标的影响，并从摄入能、消化能、肝组织能荷等方面进行探讨。结果发现，大黄可降低大鼠肝组织ATP酶含量及活性。通过对大黄水煎液和大黄含药血清指纹图谱分析，证实大黄含药血清含有大黄的主要成分大黄素[2]。2016年10月～2017年1月，本研究用大黄含药血清对乳鼠原代肝细胞进行体外干预，从细胞水平反映寒性中药大黄对能量代谢的影响，为进一步研究寒热药性对能量代谢的影响机制提供细胞模型及理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器来源 雄性SD大鼠20只[体质量(250±20)g]、SD乳鼠(3～5日龄)20只由山东中医药大学动物实验中心提供。大黄，产地甘肃岷县(掌叶大黄)，经鉴定为蓼科植物掌叶大黄的根茎。DMEM高糖培养基购自美国GIBICO公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胶原酶Ⅳ、罗丹明123、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)标准品购自美国Sigma公司；超微量ATP酶测试盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白测定试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；乙腈购自天津科密欧化学试剂有限公司。超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外可见分光光度计购自上海元析仪器有限公司；激光共聚焦显微镜(LSM 510)购自德国蔡司公司；高效液相色谱仪等购自美国安捷伦公司。

1.2 大黄含药血清制备[3]大黄制成2.7 g/mL水煎液。20只雄性SD大鼠适应性饲养1周，随机取10只给予10 mL/kg生理盐水灌胃，另外10只给予10 mL/kg大黄水煎液灌胃，2次/d，连续3 d。末次给药前12 h禁食，末次给药后1 h用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，无菌分离血清；56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤器过滤除菌分装，-80 ℃储存备用。20%大黄含药血清培养液配制：DMEM高糖培养液39.5 mL加入大黄含药血清10 mL、青霉素-链霉素混合液0.5 mL混匀。20%空白血清培养液配制：DMEM高糖培养液39.5 mL加入空白血清10 mL、青霉素-链霉素混合液0.5 mL混匀。

1.3 乳鼠原代肝细胞培养[4，5]及药物处理 75%乙醇擦拭乳鼠，超净工作台内冰盘下断头取肝脏，剥除包膜和结缔组织，PBS清洗后剪切成1 mm3大小的组织块，PBS再次吹打清洗后加入0.2%的胶原酶，于4 ℃冰箱静置消化过夜。加完全培养液2 mL终止消化后用吸管吹打，吹打后的悬液200目尼龙网过滤，4 ℃冰箱静置20 min，弃悬液。加入完全培养液1 mL，1 000 r/min离心5 min，弃上清。重复离心3次后将吹打均匀的细胞悬液转移到培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。6～10 h 内对培养的细胞进行第1次换液，培养24 h细胞融合度达70%～80%后随机分为含药血清组和空白血清组，分别用20%大黄含药血清培养液和20%空白血清培养液继续培养24 h后用于指标检测。

1.4 肝细胞内ATP酶活性测定 收集两组细胞，调整细胞为1×107/mL，超声波细胞破碎仪破碎后用于试剂盒检测。经用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，以每小时每毫克蛋白中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位。

1.5 肝细胞内ATP含量及能荷测定 色谱条件：流动相：乙腈(A)-50 mmol/L磷酸钠(磷酸调pH=7)、10 mmol/L四丁基溴化铵(B)，VA∶VB=5∶95；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃。

样本处理：用直径10 cm细胞培养皿培养细胞，血清干预24 h后，4 ℃ PBS冲洗2遍，尽量弃净PBS，秤培养皿重量；胰酶消化，4 ℃、1 000 r/min离心，弃上清，加入0.5 mol/L冰冷高氯酸500 μL，轻柔混匀后迅速置于液氮中保存；再次秤培养皿重量，计算重量差值。将样本从液氮中取出冰上溶解，超声波细胞破碎仪破碎细胞，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清；加入1 mol/L NaOH调pH至中性，再次4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清，-20 ℃保存。检测前0.22 μm滤膜过滤。对照品制备：精密称取对照品ATP、ADP、AMP适量，加流动相分别溶解至0.05、0.03、0.06 mg/mL，4 ℃储存备用。ATP、ADP、AMP含量=(样品峰面积×对照品的浓度)/(对照品峰面积×样品浓度)；能荷=(ATP+0.5×ADP)/(ATP+ADP+AMP)

1.6 肝细胞线粒体膜电位测定 取两组细胞培养24 h，用PBS缓冲液冲洗后每孔中滴加10 μg/mL罗丹明工作液200 μL避光孵育30 min；去除工作液，PBS冲洗后加入培养液200 μL，避光室温放置30 min，激光共聚焦显微镜观察染色细胞的形态。以荧光强度表示线粒体膜电位。

2 结果

2.1 大黄含药血清对原代肝细胞ATP酶活性的影响 空白血清组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性分别为(1.59±0.015)、(1.62±0.060)U/(mgprot·mL)；含药血清组分别为(1.14±0.081)、(0.57±0.066)U/(mgprot·mL)。与空白血清组比较，含药血清组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性低(P均<0.05)。

2.2 大黄含药血清对原代肝细胞ATP含量及能荷的影响 空白血清组ATP含量为(1.32±0.170)μg/g、能荷为0.228±0.074；含药血清组分别为(0.95±0.324)μg/g、0.155±0.029。与空白血清比较，含药血清组ATP含量低(P<0.05)；两组能荷比较，P均>0.05。

2.3 大黄含药血清对原代肝细胞线粒体膜电位(荧光强度)的影响 空白血清组荧光强度为92.6±6.431、含药血清组为78.9±5.603，与空白血清组比较，含药血清组荧光强度低(P<0.05)。

3 讨论

大黄是寒性中药的代表药。课题组前期通过体内实验发现大黄可降低大鼠肝组织ATP酶活力，减少肝组织ATP含量及能荷；并通过基因组学证实大黄通过调控机体防御反应及花生四烯酸代谢相关基因的表达抑制机体能量代谢，降低能量储备[6]。前期研究采用中药图谱指纹技术证实大黄含药血清含有大黄主要成分大黄素，可替代中药水煎液用于体外实验，避免了中药水煎液酸碱度、渗透压等因素对实验结果的干扰。机体能量代谢和药物代谢主要发生在肝脏，与永生化的大鼠肝细胞株相比，大鼠原代肝细胞保留了肝细胞原有的特性和代谢酶类，具有与在体动物实验模型相似的药效评价能力[7]。

能量代谢包括能量的合成与分解。ATP是生物体能量的“通用货币”，其生成和消耗情况将直接反映机体能量代谢水平的高低。ATP酶是存在于细胞器生物膜的蛋白酶，在将ATP催化水解为ADP和磷酸根离子并释放大量能量的同时维持着细胞内外离子浓度。其活性升高伴随着ATP消耗增加。故两者均为衡量能量代谢水平以及线粒体功能的重要指标。本研究中大黄含药血清干预后的肝细胞两种ATP酶活性均显著降低，提示寒性中药大黄降低了细胞的能量消耗。细胞内ATP含量的变化直接反映了细胞的能量储备。细胞内ATP含量受两个因素的调控，即氧化磷酸化合成ATP的能力和细胞利用ATP的能力。经大黄含药血清干预后的肝细胞在ATP消耗减少的前提下，细胞内ATP含量仍较空白血清组明显降低，提示细胞内ATP的生成受到明显抑制，说明大黄从分子水平抑制能量的合成。细胞能荷是指在总的腺苷酸中所负荷的高能磷酸基总量，是反应细胞能量生成和利用的平衡状态的指标。本研究中大黄含药血清干预后的肝细胞能荷有下降趋势，但与空白血清组比较差异无统计学意义，考虑可能与ATP减少的同时ADP、AMP相对增高及药物干预时间较短，细胞能量生成和利用尚未进入失代偿阶段有关。

线粒体是细胞能量产生和供应的主要场所，其氧化磷酸化产生了机体80%的ATP[8]。线粒体膜电位的稳定是氧化磷酸化过程的必要条件[9]，因此线粒体膜电位是评价线粒体功能的关键指标，可单独用来衡量线粒体产能状态。本研究中含药血清组肝细胞线粒体膜电位较空白血清组下降，提示大黄可能通过影响线粒体功能抑制了ATP的产生。肝细胞线粒体膜电位下降可能与以下因素有关：一是大黄抑制氧化呼吸链活性，导致线粒体内外膜两侧的电位差下降，从而使线粒体膜电位下降。二是大黄通过某种途径抑制了ATP合成酶活性。因ATP合成酶的F0亚基能够让线粒体内膜外侧的H+回流，进而推动合成ATP。当ATP合成酶活性下降时，线粒体内膜外侧的H+回流减少，线粒体膜电位下降，ATP合成减少[10]。本研究结果表明，大黄含药血清显著减少大鼠原代肝细胞能量储备，降低细胞能量代谢。以往中药药性与能量代谢相关的研究主要集中在动物模型及体内实验，采用含药血清干预原代细胞建立模型进行药物寒热药性及能量代谢研究鲜有报道，因此可采用上述方法建立细胞寒证模型，为体外进行寒热药性对能量代谢的影响搭建细胞平台，有利于体外高通量进行寒热药的能量代谢研究，进一步阐示寒热药性的本质及性效发生规律，为更好地指导临床用药奠定基础。

[1] 王艳艳,孙雪,裴晓蕾,等.中药寒热药性与线粒体能量代谢关系研究[J].中医药信息,2013,30(4):48-50.

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EffectofserumcontainingDahuang(rhubarb)onenergymetabolismofratprimaryhepatocytes

KANDongfang1,JIXuming,CHENQian,HANXiaochun,WUJibiao

(1CollegeofTraditionalChineseMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

ObjectiveTo observe the effect of serum containing Dahuang (rhubarb) on energy metabolism of rat primary hepatocytes.MethodsMedicated serum was prepared on SD rats. Hepatocytes were isolated from SD neonatal rats by collagenase digestion and then were randomly divided into the blank serum group and medicated serum group. Cells in the two groups were cultured with 20% blank serum and 20% serum containing Dahuang (rhubarb) for 24 hours, respectively. The activities of Na+-K+-ATPase, and Ca2+-Mg2+-ATPase were detected with spectrophotometer. The content of ATP, ADP, and AMP was tested with high performance liquid chromatography (HPLC) as well as energy charge. The mitochondrial membrane potential was analyzed with rhodamine 123 by laser confocal microscope.ResultsCompared with the blank serum group, the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase decreased (allP<0.05) and the content of ATP decreased in the medicated serum group (P<0.05). There was no significant difference in the level of energy charge between the two groups (P>0.05). Compared with the blank serum group, the mitochondrial membrane potential decreased in the medicated serum group (P<0.05).ConclusionThe serum containing Dahuang (rhubarb) may inhibit the energy metabolism and reduce the energy reserve of rat primary hepatocytes by regulating mitochondrial function.

hepatocytes; energy metabolism; serum containing Dahuang (rhubarb); traditional Chinese medicine; rats

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.003

R285.5

A

1002-266X(2017)37-0009-03

国家重点基础研究发展计划(2007CB512601，2013CB531803)；国家自然科学基金面上项目(81673852)；山东省重点产业关键技术项目(2016CYJS08A01-4，2016CYJS08A01-3)。

阚东方(1984-)，女，在读博士，主要研究方向为中药药性。E-mail：893181869@qq.com

武继彪(1963-)，男，教授，主要研究方向为心脑血管疾病的防治。E-mail：wujibiao1963@163.com

2017-07-14)