黄色金针菇菌株提纯复壮技术研究

刘昆昂 张根伟 马 宏 李书生 刘振国 付艳菊

（河北省科学院生物研究所，石家庄050081）

金针菇（Flammulina velutipes）又名构菌、冬菇、毛柄金钱菌等[1]，按子实体颜色的深浅可将金针菇分为黄色品系、白色品系、淡黄色品系[2]。黄色金针菇是我国传统金针菇生产品种，相对于白色金针菇，具有产量高、口感好、抗性强等特点。金针菇菌种作为金针菇栽培的基础生产资料，对产量和质量起着关键性作用。然而黄色金针菇主要是散户栽培，由于科研投入不足、管理不善，金针菇菌种在保藏及传代过程中出现生产周期延长、产量下降、容易感染等退化现象。

菌种退化分为可逆和不可逆两种类型，可逆的退化现象可通过提纯复壮恢复其优良特性[3]。生产上常用的菌种提纯复壮方法有，（1）“断桥法”和菌丝尖端分离提纯复壮，其特点是仅可筛选出生长速度快的菌株，而生长速度快往往并非高产优质食用菌菌株[4]；（2）原生质体再生法:需要产生大量原生质体，并对产生的大量原生质体进行分离、筛选和出菇验证，技术难度较大[5]。

研究以黄色金针菇苏金6 号为样本，通过在含有不同浓度结晶紫的PDA 培养基培养后，采用菌丝尖端分离和原生质体再生相结合的方法进行提纯复壮。此方法较常规金针菇提纯复壮方法更简便、更高效。

1 材料与方法

1.1 供试菌株黄色金针菇品种苏金6 号，引自河北省创新食用菌研究所，生产中主要表现为污染率高、生产周期延长、产量下降、畸形菇增多等。

1.2 培养基①PDA 培养基（g/L）:马铃薯200，葡萄糖20，磷酸二氢钾3，硫酸镁1.5，蛋白胨2，琼脂12；②再生培养基:PDA 培养基+ 0.6 mol/L 的甘露醇；③栽培培养料:棉籽皮83%，麸皮15%，石灰1%，石膏1%；料水质量比1∶1.3；④木质素酶显色培养基:1%梨木屑煮汁＋0.02%愈创木酚＋1.2%琼脂；⑤纤维素酶显色培养基:0.2%微晶纤维素＋0.02%刚果红＋1.2%琼脂。

1.3 提纯复壮培养取供试菌株试管种不同部位菌块，分别接入含有0～40 mg/L 结晶紫的PDA 培养基中，26℃培养，待菌丝将要长满皿，挑取菌丝尖端，转入PDA培养基中，26℃培养，比较生长情况。

1.4 锁状联合观察计数菌株接入铺有玻璃纸的PDA培养基中，26℃培养，待菌丝长到玻璃纸上，400倍显微镜下观察视野中锁状联合数量。

1.5 酶解液1%蜗牛酶（Snailase）+1%溶壁酶（Sig⁃ma），用0.6 mol/L MgSO4配制，经4000 r/min 离心20 min 后，上清液无菌条件下用0.45 μm 微孔滤膜过滤除菌后，分装于10 mL 试管中，4℃冰箱保存备用。

1.6 原生质体再生对提纯复壮处理的菌株进行原生质体再生，取金针菇斜面菌丝碎片，接入盛有30 mL 液体PDA 培养基的100 mL 三角瓶中，25℃左右静置培养7 d。过滤收集菌丝体，分别用无菌水和0.6 mol/L 的MgSO4各洗涤1 次。按菌丝重∶酶液量为150 mg∶1 mL 的比例将菌丝置于酶解管中，30℃酶解3 h，每隔1 h 振荡并镜检原生质体释放情况。酶解完毕后，用6 层擦镜纸过滤，以除去残留菌丝。滤液经1000 r/min离心后弃上清液收集沉淀，用0.6 mol/L 的MgSO4洗涤2 次，得到纯化的原生质体。取0.1 mL 原生质体悬液梯度稀释，涂布于再生培养基平板，25℃下恒温培养，4～6 d即见再生菌落[6]。

表1 不同质量浓度结晶紫培养基培养对苏金6号的提纯复壮作用

1.7 再生菌株的筛选挑取再生菌株到PDA 培养基中，26℃培养，挑选生长快、长势好、菌丝粗壮、锁状联合多而整齐；同法接入栽培料中，测定生长速度，重复3次[7]。

1.8 再生菌株的酶活测定变色圈法测定木质素和纤维素酶活性。菌块接入PDA 培养基平皿中部，满皿后用打孔器在菌落边缘取直径50 mm 的菌饼，接入显色培养基中，分别在5、10、15、20、25℃和30℃培养3 d，测定变色圈直径[8]。

1.9 栽培试验用聚丙烯塑料袋（17.5 cm×40 cm×0.005 cm）装料，每袋约装干料400 g，以套环封口。高压灭菌（121～126℃）维持2 h，待料温降至25℃以下，按无菌操作规范接种，各接30袋。置于20～28℃培养室内发菌，菌丝满袋后按再生法进行催蕾—开袋—抑制—再生菇培养等工艺进行出菇管理[9]。当子实体长至16 cm 左右，菌盖直径小于1 cm 及时采收。复壮效果。

图1 出发菌株及再生菌株的菌丝形态观察

2.2 原生质体再生菌株筛选

2.2.1 提纯复壮培养对原生质体再生的影响 对20 mg/L 结晶紫提纯复壮培养的菌株进行原生质体再生，并设出发菌株对照。挑取再生菌株各100株，初筛各得到60株长势较强、生长快的菌株，经传代3次后在PDA 培养基上进行比较。处理组筛选得到的菌丝生长速度≥7 mm/d 的菌株为45 个，达到75.0%，而对照仅14个，占13.3%；处理组400倍显微镜下，视野中平均锁状联合数量为28.6 个，而对照组平均锁状联合数量为22.4 个。可见，含有结晶紫PDA 培养基提纯复壮培养，可以显著提高金针菇原生质体再生的筛选效率。

2 结果与分析

2.1 提纯复壮培养结果一定质量浓度的结晶紫可抑制金针菇菌丝生长，尤其对细胞壁不完整的退化菌丝产生更大的杀伤作用；而抗性强的菌丝，可以观察到:菌丝生长停顿1～2周后，部分萌发点成扇形向外生长。由表1可知，在含有1～40 mg/L结晶紫的PDA 培养基中培养，随着浓度增加，满皿时间逐步延后；20～40 mg/L 处理时，提纯复壮的菌株，平均生长速度、长势和菌丝密度达到最大；如图1 所示，400 倍显微镜下观察可见菌丝生长整齐、粗壮，锁状联合数量最多，而且组间差异不显著。因此，含有20 mg/L 结晶紫的PDA 培养基即可以达到最佳提纯

2.2.2 原生质体再生菌株筛选 筛选生长快、长势强、菌丝密度大、锁状联合数量多的菌株。如表2所示，5 株菌在PDA 培养基和棉籽皮基质上菌丝长速都快于出发菌株，而且长势强、菌丝密度大、锁状联合规则而且多；但两种基质上的生长速度并不成正比，例如，在PDA 培养基以13D10 生长最快，达到9.25 mm/d，但在棉籽皮基质上菌丝生长速度排第二位，为4.90 mm/d；而棉籽皮基质上生长速度最快的13B7，达到5.01 mm/d，PDA 培养基上生长速度排第三位，为8.93 mm/d。

2.2.3 木质素、纤维素酶活性比较 对筛选的再生菌株进行木质素和纤维素酶活测定。结果如表3、表4 所示，再生菌株木质素和纤维素酶活性均高于对照。20～30℃条件下，木质素酶活性由高到低依次为:13B7＞13C9＞13C10＞13D10＞13A2＞CK；纤维素酶活性由高到低依次为:13B7＞13C9＞13D10＞13A2=13C10＞CK。5～15℃条件下，木质素酶活性由高到低依次为:13D10＞13B7＞13C9＞13A2＞13C10＞CK；纤维素酶活性由高到低依次为:13C9＞13B7＞13D10＞13A2=13C10＞CK。其中，13B7在中高温具有最高的酶活性，低温酶活性排在第二位；13A2 在各温度点酶活均相对低。

2.3 出菇试验结果选取13B7、13D10、13C9 和13C10四株生长速度快、酶活高的再生菌株进行出菇试验。结果如表5 所示，再生菌株可缩短满袋时间5～6 d，提高产量11.2%～15.5%，均为优于亲本的高产菌株。以13B7产量最高，达到381 g/袋，增产15.5%，生物学效率为95.3%。同时发现，生长速度慢于13D10 和13C9 的13B7 出菇最早，而且产量最高，可见菌株的长速与产量之间并不一定存在正相关性，提示我们菌株筛选要从多方面考虑，以免漏筛。

表2 在PDA培养基和栽培料（棉子壳）上原生质体再生菌株的菌丝生长情况

表3 在不同温度下再生菌株的木质素酶活（变色圈直径）/mm

表4 在不同温度下再生菌株的纤维素酶活性（变色圈直径）/mm

表5 复筛（再生）菌株与出发菌株的出菇试验

3 小结与讨论

在食用菌菌株的脱毒复壮中，采用的方法主要有菌丝尖端脱毒法、原基组织脱毒法、原生质体再生法等。相比原生质体再生法，菌丝尖端分离不容易得到纯的提纯复壮的菌株，但以退化的菌株直接进行原生质体再生，无疑增加了筛选的工作量，也很难达到满意的效果。研究提供的提纯复壮方法，不但使退化菌株在生长速度、木质素和纤维素酶活和产量均有提高，而且在形态上也有差异，退化的菌株细胞壁破损、穿孔，菌丝生长不整齐，而再生菌株生长快，锁状联合多而且规则。另外，当培养温度在20～30℃时，在生长速度相近的情况下，产量与木质素酶活、纤维素酶活成正相关。这可能和试验中中温发菌培养有关。试验结果表明，在优良菌株提纯复壮筛选过程中，可以从不同温度下酶活、形态特征角度进一步筛选。此外，笔者还对黄色金针菇杂19进行了提纯复壮，从菌丝形态角度判断杂19菌株退化较轻，提纯复壮菌株增产幅度低于苏金6号。初步判断，此方法更适合于退化的金针菇菌株的提纯复壮。