桦褐孔菌菌质提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

李东文 苏明声 龙 凯 梁永红 谢小梅

（1 江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室，南昌330004；2 江西中医药大学药学院，南昌330004）

桦褐孔菌学名为Inonotus obliquus（Pers.:Fr.）Pi⁃lat，又名斜生褐孔菌、白桦茸，是一种珍稀药用真菌，菌核外形呈现出瘤状，表面深褐色并有许多深的裂痕，质地硬且脆[1]。桦褐孔菌含有多糖类化合物、芳香物质、叶酸衍生物、多酚类化合物、甾体类化合物和三萜类化合物等多种活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和防治糖尿病等多种生理活性[2]。尤其桦褐孔菌在防治糖尿病方面的应用更是受到普遍关注，俄罗斯Komsomlshi 制药公司生产的桦褐孔菌精粉对糖尿病的治愈率达93%。但目前桦褐孔菌资源匮乏，野生资源日益枯竭，现有的资源量已经满足不了大量的临床需求[3]。研究运用双向固体发酵技术[4]，以桦褐孔菌为发酵菌种，中药渣为发酵基质，在特定条件下进行固体发酵，获得了药性菌质--桦褐孔菌菌质。测定桦褐孔菌菌质不同溶剂提取组分对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性，为实现利用中药渣的同时获取具有降糖活性的桦褐孔菌菌质提供实验依据。

1 材料与方法

桦褐孔菌菌质（简称“菌质”，简写“JZ”），实验室自制（自制过程另文发表）。桦褐孔菌菌核（简称“菌核”，简写“JH”），购自延边华厦桑黄菌业有限公司，罗永明教授鉴定。

淀粉、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、PNPG 均购于Sigma 公司；阿卡波糖对照品（Solarbio），其余试剂均为国产分析纯。UV-2102 型紫外-可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），DK-8D 型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 活性物质的提取（另文发表） 简述如下:取桦褐孔菌菌质和菌核粗粉1 kg，按1∶12（g∶mL）的比例分别加入80%乙醇回流提取（1 h/次，提取3 次）。提取液合并后减压回收溶剂，得乙醇浸膏，将乙醇浸膏混悬于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别减压回收溶剂，得各萃取组分。取乙醇浸提后的残渣热水浸提，提取液浓缩后醇沉得粗多糖。

1.2.2 抑酶活性测定

1.2.2.1 各组分对α-淀粉酶抑制活性的测定 淀粉酶与底物淀粉发生反应生成还原糖，还原糖与DNS 共热后在过量的NaOH 溶液中被还原生成具有特征吸收峰的橘红色氨基化合物，在一定的浓度范围内氨基化合物的吸光度值与α-淀粉酶的活性成正比[5]。

参照文献[5]改进后的反应体系为:1 mL 的抑制剂（样品），0.3 mL 的α-淀粉酶溶液（酶活为6 U/mL，用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液配制），0.4 mL 1%的淀粉溶液（用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液配制），37℃反应5 min，加1 mL 的DNS 试剂沸水浴10 min，取出冰水冷却，定容至25 mL，540 nm测吸光度，以阿卡波糖作阳性对照。具体参照表1，空白处用等体积的pH6.8，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液补足。

表1 α-淀粉酶活性抑制体系

1.2.2.2 各组分对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定pNPG（4-硝基酚-α-D-吡喃-葡萄糖苷）在α-葡萄糖苷酶作用下水解生成葡萄糖和pNP（对硝基苯酚），pNP在碱性环境下呈黄色在400 nm处有最大吸收[6]。

参照文献[7]改进后的反应体系为:1 mL 的抑制剂（样品），0.2 mLα-葡萄糖苷酶（酶活为3.75 U/mL，用pH6.8，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液配制），0.2 mL pNPG溶液（6 mmol/L 用pH6.8，0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液配制），37℃恒温水浴30 min，加6 mLNa2CO3溶液（0.1 mol/L）终止反应，400 nm 处测吸光值，以阿卡波糖作阳性对照。具体参照表2进行，空白处用等体积的pH6.8，0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液补足。

表2 α-葡萄糖苷酶活性抑制体系

2 结果与分析

2.1 各组分对α-淀粉酶抑制率根据公式，抑制率/%=（1-A00/A01）×100；A00=A3-A4，A01=A1-A2；式中:A1、A2、A3、A4分别为540 nm 处空白管、空白对照管、样品管和背景管的吸光值。通过计算菌质、菌核石油醚组分的抑制率为0，其它各组分的抑制率见表3，图1。

表3 不同组分对α-淀粉酶抑制率（%）

由表3 结合图1 可清晰看出，菌质和菌核粗多糖对α-淀粉酶抑制率与阳性对照阿卡波糖相比，差异极显著（P＜0.01），但比相应的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水层提取物、石油醚提取物的抑制率高，差异极显著（P＜0.01）；菌核粗多糖对α-淀粉酶的抑制作用比菌质高，差异显著（P＜0.05）。

2.2 各组分对α-葡萄糖苷酶抑制率根据公式，抑制率/%=（1-A00/A01）×100；A00=A3-A4，A01=A1-A2；式中:A1、A2、A3、A4分别为400 nm 处空白管、空白对照管、样品管和背景管的吸光值。通过计算菌质、菌核石油醚组分的抑制率为0，其它组分的抑制率见表4，图2。

由表4 及图2 可清晰看出，菌质和菌核粗多糖对α-葡萄糖苷酶抑制率与阳性对照阿卡波糖相比，差异极显著（P＜0.01），但比相应的乙酸乙酯、正丁醇、水层提取物、石油醚的抑制率高，差异有统计学意义（P＜0.01）；菌核粗多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用比菌质高（P＜0.05）。

图1 桦褐孔菌菌质和菌核不同溶剂提取组分对α-淀粉酶抑制率随样品质量浓度变化趋势

图2 桦褐孔菌菌质和菌核不同溶剂提取组分对α-葡萄糖酶抑制率随组分质量浓度变化趋势

表4 不同组分对α-葡萄糖苷酶抑制率（%）

3 小结与讨论

α-葡萄糖苷酶的抑制剂能够竞争性抑制小肠上皮绒毛膜刷状缘上多种酶的活性[8]，α-淀粉酶抑制剂能够有效抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性[9]，这两种酶抑制剂通过调控碳水化合物的降解，延缓葡萄糖在肠道内的吸收，进而降低餐后血糖，是目前进行糖尿病防治比较有效的方法。研究通过测定桦褐孔菌菌质不同溶剂提取组分对这两种酶的抑制活性，并与菌核进行了比较，结果表明，菌质和菌核粗多糖提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有较高的抑制作用。

目前桦褐孔菌降糖作用有效成分的研究主要集中在其水提物和多糖上[10]，还有研究证实其乙酸乙酯（提取）组分能较好的降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖[11]。对比桦褐孔菌菌质和菌核提取各组分对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，发现不管菌核还是菌质其抑制作用较强的组分均是粗多糖。

可见通过双向固体发酵技术制得的桦褐孔菌菌质提取物能较好抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，其活性成分的分离鉴定和药理作用还有待进一步研究。双向固体发酵技术其工艺简单，设备要求不高，成本也较低，并能将中药渣重新开发利用，不仅节约了资源，而且弥补了名贵药用真菌桦褐孔菌野生资源短缺，为桦褐孔菌资源的来源增添了一条新的途径，后续将对菌质多糖的降糖作用进一步研究。