JAK2基因阴性骨髓增殖性肿瘤与CALR基因突变的相关性诊断研究进展

杜晨霄 张学美

(昆明医科大学第一附属医院血液内科，云南 昆明 650000)

JAK2基因阴性骨髓增殖性肿瘤与CALR基因突变的相关性诊断研究进展

杜晨霄 张学美

(昆明医科大学第一附属医院血液内科，云南 昆明 650000)

骨髓增殖性肿瘤；JAK2基因；CALR基因；突变

长久以来，国内外大量研究都证实了Janus激酶2(Janus kinase 2, JAK2)基因突变在骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative diseases, MPD)中的高发阳性率，2016年世界卫生组织诊断标准也重申了JAK2基因作为诊断MPD的重要性。虽然JAK2基因的体细胞突变发生在许多MPD中，但是仍存在大量JAK2阴性的骨髓增殖性肿瘤，且其分子发病机制仍不明确。因此这类肿瘤的诊断标准亟待进一步研究。近年来，国外研究表明：采用全基因组测序(whole ge-nome shot-gun，WGS)技术在JAK2阴性的一组MPN患者中，发现一新的高频基因突变：钙网蛋白(Calreticulin，CALR)基因突变[1-2]。

1 CALR蛋白结构及功能

CALR是一种多功能蛋白，在内质网中充当主要的Ca2+结合蛋白。该蛋白大量存在于非肌肉组织中，结合钙离子能力极强。其分子生物学结构和功能区为N-末端区、P区和C-末端区。N末端区包含(1～180)氨基酸残基，其中氨基酸序列结构最为稳定，有球形β-折叠结构；P区包含(181～280)氨基酸残基，含脯氨酸，由两条发卡结构的β-折叠；C-末端呈强酸性，能结合大量钙离子，但亲和力低，且C-末端富含内质网滞留信号(ER retention signal，KDEL)四肽序列。最近有研究表明，CALR在内质网内，可确保新合成的糖蛋白能正确折叠，并参与调节钙的稳定状态[3]；而在细胞外液中，CALR参与、调节多种生物过程，包括细胞的增殖、分化、凋亡及吞噬和免疫抗原提呈应答[4-5]。研究者利用WGS技术在大量的JAK2阴性MPN成年患者中检测出了CALR异常[1]，称为CALR基因突变[7]。

2 CALR突变对MPN患者有核红细胞的影响

CALR是一种Ca2+结合蛋白，其在能与其N/P结构域结合的蛋白质细胞区室之间穿梭。根据研究表明，多数CALR基因突变与JAK2V617F基因突变不共存，因此CALR基因阳性表达的细胞内JAK2基因为阴性[10-14]。根据人类促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)参与诱导下的钙离子通道激活的途径，有研究者[13]明确了CALR蛋白参与红细胞生成的原理，他们通过Western印迹法，发现MPN患者组与正常对照组在体外生成红细胞(骨髓有核红细胞)时分别在细胞液中表达了不同的CALR浓度。Ca2+只在正常成红细胞内调解CALR的结构。正常成红细胞主要在细胞表面的C末端结构域(C-CALR)和细胞基质中的N末端结构域(N-CALR)表达，且其表达随着两个表位的结构成熟度降低。由此可知，在JAK2基因阴性的CALR基因阳性MPN患者中，由于CALR基因突变，导致高水平的Ca2+表达[6]。在正常成红细胞胞质中，C-CALR的应激反应表达与糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptors，GR)有关。在这些细胞中，Ca2+通道的减少和细胞核抑制增加了GR核素定位，同时在GR激动剂地塞米松作用下减少胞质中C-CALR- N-CALR/GR连接及增殖的检测率。C-CALR/GR和地塞米松反应被Ca2+和EPO的增加而替代。通过对比，患者组的原始红细胞细胞膜表达的N-CALR为正常水平，但细胞核的C-CALR表达几乎检测不到。这些细胞的GR主要存在细胞核内，并对地塞米松受体激动剂无应答。药物Ruxolitinib可拆解C-CALR, C-CALR/GR连接并对抗MPN患者细胞中的地塞米松反应，且此药物的作用为拮抗细胞核分裂及抑制钙离子。这些结果表明Ca2+诱导的钙网蛋白的构象变化调节正常成红细胞中GR的细胞核分裂，而JAK2V617F基因阳性让MPN患者的Ca2+失去这项功能，反之在CALR基因阳性MPN患者中Ca2+高度活跃[13]。

3 JAK2基因阴性的CALR基因突变与MPN患者临床表现及预后的相关性研究

2013年，有研究[10]发现CALR基因中的复发突变，与JAK2基因突变相互排斥。该小组以一组MPN患者为对象(184例患者)研究CALR突变的发病率和分子特征。数据分析显示JAK2突变和CALR突变组之间存在显著差异，ET患者中，JAK2阳性的患者血红蛋白水平和白细胞计数明显高于JAK2阴性的CALR阳性患者；但其血小板计数明显高于前者。JAK2阴性的CALR基因阳性ET患者初诊年龄也较年轻。在骨髓纤维化期MPF患者中，CALR+患者的贫血程度较JAK2+患者更轻。Rotunno等[17]研究发现CALR阳性和JAK2阳性ET 患者10年累积血栓形成风险各自为5.1% 和14.5%，15年累积血栓形成风险各自为10.5% 和25.1% 。2016年，有研究者[6]根据最近WHO诊断标准对120例BCR-ABL0的MPN患者进行骨髓CALR和JAK2基因突变测序，并分析CALR基因突变患者的临床及实验室特点，结果发现：120例中样品中，42例PV患者中38例JAK2阴性患者中未检出CALR基因突变，39例ET患者中CALR阳性率在JAK2阴性ET患者中检出率为12/22；39例PMF患者中，CALR阳性率在JAK2阴性PMF中检出率为12/21。120 例患者中均未检测到MPLW515 突变，结果中JAK2V617F、JAK2 Exon12、CALR、MPLW515 四种基因突变不共存[6,15]。英国研究室用WGS测序法测定3412例样本CALR基因表达及突变，在对151例MPN患者样本进行外显子测序后发现，在无JAK2或MPL突变的MPN患者中，大多数存在CALR的体细胞突变。而CALR和JAK2、MPL突变不共存，97%的患者只存在这3种突变中的一种[19]。在表型水平，JAK2阴性CALR突变的ET患者中大部分患者的PLT计数大于1000×109/L。尽管如此，CALR突变ET患者的血栓形成风险显着低于JAK2阳性ET患者，甚至在调整年龄后亦是如此。这些观察结果与最近对891名WHO定义的ET患者的研究结果非常一致[15]。这些研究清楚的表明JAK2(V617F)是血栓形成的强烈独立危险因素，而PLT计数大于1000×109/ L则与较低的血栓风险相关。JAK2(V617F)基因检测阴性和显着升高的PLT计数是CALR突变ET的主要特征。这些数据阐明了PLT计数本身在ET患者的血管并发症的发病机制中的作用。他们强调了粒细胞/ PLT活化[16]和增加的WBC计数[14]与PLT计数本身更可能与血栓形成并发症的发病机理相关的观点。CALR基因突变对于患者脾肿大的发病率没有统计学相关性；而血红蛋白，血小板和WBC计数不影响血栓形成的风险[11-12]。

4 结果及总结

检测CALR突变有助于对JAK2基因阴性的ET患者进行相应的分子诊断。 由于CALR阳性患者的血栓形成减少，可以说相对于JAK2 V617F基因突变的患者，前者具有更少的血栓形成指征和更好的预后。 因此，检测CALR突变可能有助于ET患者的诊断和预后[11]。在ET 患者中CALR 突变阳性患者白细胞计数、危险度分层、血事件发生率低于JAK2 V617F 突变阳性患者；PMF 患者中CALR 突变阳性患者血红蛋白浓度低于JAK2 V617F 突变阳性患者。结论为JAK2基因阴性MPN 患者中CALR 突变阳性患者与JAK2 V617F 突变阳性患者相比，发生血管事件风险更低、危险度分层更低且发病年龄小，因此预后较好。

不同类型的基因突变在PV、ET和PMF患者中的发生率差异较明显，总体来看JAK2基因突变发生率较髙，且在PV患者中该突变的发生率高于ET和PMF患者。MPL基因突变阳性率较低，主要发生在ET和PMF患者中；CALR基因突变主要见于JAK2突变阴性的ET和PMF患者。JAK2基因突变与MPN患者临床表现具有相关性，突变阳性的PV患者有着更高的外周血WBC、PLT计数水平；突变阳性的ET患者白细胞计数高于阴性，突变阴性患者外周血PLT计数较髙，其血栓发生率要高于CALR阳性的JAK2阴性MPN患者。

目前已知的与JAK2阴性MPN肿瘤发病有关的基因突变有多种，临床试验中也不断检测出更多导致肿瘤发生的基因突变，而CALR基因点突变的发现，让PV、ET、PMF的发病机理的研究在分子层面有了很大的突破，对病人的明确诊断和治疗也有很大的帮助。综上所述，研究CALR基因对PMF患者临床表现与预后关系可以提高肿瘤确诊率，并对相关临床症状进行合理治疗有所贡献，亦对患者预后评估有着很大帮助。

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山东省自然科学基金项目(2013GCC08)。

杜晨霄(1990—)，女，山东泰安人，昆明医科大学硕士研究生在读，主要从事血液病和血液肿瘤研究和临床工作。

张学美，E-mail: zxm8955@ sohu.com。

R733.3

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1004-7115(2017)07-0838-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.07.048

2017-04-02)