化痰除湿祛瘀剂膝痹康对膝骨关节炎患者软骨细胞凋亡调控基因表达的影响※

孟祥奇 梁国强 尢君怡 马奇翰

(江苏省苏州市中医医院骨伤科，江苏 苏州 215003)

实 验 研 究

化痰除湿祛瘀剂膝痹康对膝骨关节炎患者软骨细胞凋亡调控基因表达的影响※

孟祥奇 梁国强1尢君怡 马奇翰△

(江苏省苏州市中医医院骨伤科，江苏 苏州 215003)

目的 研究化痰除湿祛瘀剂膝痹康对人骨关节炎( osteoarthritis，OA)软骨细胞调控基因表达的影响。方法 取全膝关节置换手术膝骨关节炎患者的软骨组织，采用酶消化培养法培养人软骨细胞，采用甲苯胺蓝染色鉴定细胞来源。将软骨细胞分为对照组、膝痹康0.016、0.08、0.4、2.0、10.0 mg/mL组，培养24 h后，应用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测各组细胞的增殖情况。根据增殖结果将软骨细胞分为对照组、膝痹康低、中、高剂量组(0.05、0.1、2.0 mg/mL)，用TUNEL法检测各组细胞凋亡情况，以实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测各组细胞Bcl-2、Bcl-2同源水溶性相关蛋白X(Bax)及p53 mRNA表达。结果 本研究成功建立了人骨关节炎软骨细胞有限细胞系，细胞生长状态良好；甲苯胺蓝染色证明所培养的细胞为来自中胚层的软骨细胞。膝痹康在0.016～10.0 mg/mL范围内对OA软骨细胞波长=450 nm处24 h的光密度(OD)有影响。与对照组相比，膝痹康低剂量组细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)，膝痹康中、高剂量组下降(P<0.05，P<0.01)。膝痹康低、中、高剂量组间比较显示，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，膝痹康低剂量组Bcl-2、Bax及p53 mRNA相对表达量无明显变化(P>0.05)，膝痹康中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量明显上调(P<0.05)，Bax及p53 mRNA表达量明显下调(P<0.05，P<0.01)；与膝痹康低剂量组相比，膝痹康中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量明显上调(P<0.05)，Bax及p53 mRNA表达量明显下调(P<0.05，P<0.01)；与膝痹康中剂量组相比，膝痹康高剂量组Bax mRNA表达量明显下调(P<0.05)。结论 化痰除湿祛瘀剂膝痹康调控细胞凋亡基因的表达，抑制软骨细胞过度凋亡，这可能是抑制软骨破坏的重要机制之一。

骨关节炎；化痰；细胞凋亡；bcl-2相关X蛋白质；基因，bcl-2；基因，p53

近年来，国内外学者通过对骨关节炎( osteoarthritis，OA)患者的关节软骨进行组织细胞学研究，从新鲜分离的软骨细胞中发现了细胞凋亡(apoptosis)的现象，并且软骨细胞凋亡的数量与OA的病程、病变程度具有高度一致性[1-2]。由此，本研究以国内外有关中医药治疗骨关节炎与软骨细胞凋亡研究的进展为思路，根据中医骨伤科治疗膝骨关节炎的丰富理论和实践经验，在前期临床及动物实验研究的基础上，观察不同浓度的化痰除湿祛瘀剂“膝痹康”(由制天南星、制川乌、薏苡仁、刺五加、丹参、地龙组成，由《太平惠民和剂局方》之小活络丹化裁而来)对体外培养的膝骨关节炎患者的关节透明软骨细胞凋亡及其调控基因B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、与Bcl-2同源水溶性相关蛋白X(Bcl-2-Associated X，Bax)和p53 mRNA表达的影响，为进一步探讨中医化痰除湿祛瘀法防治膝骨关节炎软骨细胞凋亡的分子生物学机制奠定实验研究的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞(标本来源) OA软骨标本均取自在江苏省苏州市中医医院骨伤科人工膝关节置换的原发性膝骨关节炎患者，收集截骨块。膝骨关节炎的诊断标准参照美国风湿病学会(ACR)制订的膝骨关节炎分类标准[3]以及经典Kellgren 和Lawrence 骨关节炎放射学诊断标准[4]。以上标本的取材均先告知患者并征得同意。

1.1.2 药物与试剂 中药饮片：制天南星、制川乌、薏苡仁、刺五加、丹参、地龙中药饮片，苏州市春晖堂饮片厂；DMEM培养基、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶(美国GIBCO公司)；胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium method，MTT)(美国Sigma公司)；甲苯胺蓝染色液(南京森贝伽生物科技有限公司)；细胞凋亡转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)法检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；总RNA提取试剂盒(日本TaKaRa公司)；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)逆转录试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)一抗：Ⅱ型胶原抗体，(英国Abcam公司)；二抗：羊抗兔FITC-IgG，(美国Santa Cruz公司)；引物合成为美国Invitrogen公司之上海贸易有限公司合成。其他试剂均为市售分析纯。

1.1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱(美国科峻仪器公司)；M2酶标仪(Benchmark公司)；蔡司倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)；实时荧光定量(RT-PCR)仪(美国Bio-Rad公司)；核酸蛋白分析仪(美国Beckman公司)；高速冷冻离心机(德国HERMLE公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 膝痹康药物组成：制天南星12 g，制川乌6 g，薏苡仁10 g，刺五加20 g，丹参10 g，地龙10 g。按组方剂量配比严格称取饮片，加75%乙醇，回流提取2次，第1次加醇8倍量，回流2 h；第2次加醇6倍量，回流1.5 h；滤过，合并滤液，回收乙醇至尽，清膏备用。药渣加水煎煮2次，第1次加水8倍量，煎煮2 h；第2次加水6倍量，煎煮1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.07～1.08(40～50 ℃)的清膏，与醇提清膏混匀，冷冻干燥制备成相当于2.0 g生药/g的粉末，-20 ℃密封保存备用。根据实验设计剂量现用现配。

1.2.2 人膝OA软骨细胞体外培养及鉴定 人膝OA软骨细胞的分离参考文献[5-7]釆用Ⅱ型胶原酶一步消化法，按甲苯胺蓝染色法进行鉴定，软骨细胞爬片48 h，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗，4%中性甲醛固定30 min，用1%甲苯胺蓝染色30 min，迅速用无水乙醇漂洗1次，空气干燥，镜下观察。

1.2.3 MTT法检测细胞活力 取上述第3代人膝OA软骨细胞，用含10%胎牛血清的高糖DMEM计数调整为5×104个/mL，接种于96孔培养板中( 200 μL/well)，置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养24 h贴壁后。根据药理实验方法学分别设计为：膝痹康0.016、0.08、0.4、2.0、10.0 mg/mL 5个剂量组及未加药物组(对照组)，每组设置6个复孔，作用时间分别为24 h。采用MTT法检测细胞活力，各药物浓度组细胞活力(%)=[(加药细胞OD-对照细胞OD)/对照细胞OD]×100%(OD表示光密度)。反映出细胞数量及代谢水平。

1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 另取上述第3代人膝OA软骨细胞，按每孔2×105个细胞接种软骨细胞于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h。弃原培养液，PBS缓冲液洗涤细胞3次，将0.5、1.0、2.0 mg/mL梯度浓度的膝痹康药液分别加入相应的培养孔中(2 L/well)，分别设为膝痹康低、中、高剂量组，另设未加入药物的孔板为对照组，作用24 h后，PBS缓冲液洗涤细胞3次，用4%多聚甲醛固定细胞15 min；PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2 min。用PBS缓冲液洗涤2次。按照试剂盒说明配制适当量的TUNEL检测液，充分混匀。在样品上加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS缓冲液洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察[细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180～200 bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3′-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynuc Leotidyl Transferase，TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的d UTP(fluorescein-d UTP)，从而可以通过荧光显微镜进行检测绿色荧光表达凋亡的阳性细胞数]。使用200倍放大倒置荧光显微镜观察并随机选取视野拍照，选取有代表性的图片，计数5～7 张图片的凋亡细胞和总细胞数，计算每个视野下TUNEL阳性细胞率。

1.2.5 RT-PCR检测细胞凋亡基因 另取上述第3代人膝OA软骨细胞，按每孔2×105个细胞接种于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后弃原培养液，PBS缓冲液洗涤细胞3次，根据细胞活力实验结果，将0.5、1.0、2.0 mg/mL梯度浓度的膝痹康药液分别加入相应的培养孔中(2 L/well)，分别设为膝痹康低、中、高剂量组，另设未加入药物的孔板为对照组，作用24 h。参照说明书提取各组总RNA。在20 μL逆转录体系中PCR扩增成cDNA，50 μL PCR反应体系在下列条件下行PCR扩增：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延长1 min，36个循环后，72 ℃延长10 min。其中Bcl-2引物：sense 5′-TGCACCTGACGCCCTTCAC-3′, anti-sense 5′-AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′；Bax引物：sense 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3'，anti-sense 5' -GTCCAGCCCATGAGGTTCT-3'；p53引物：sence 5′-CCTCACCATCATCACACTGG-3′，anti-sense 5′-GCTCTCGGAACATCTCGAAC-3′。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳(120 V，25 min)。应用凝胶成像及分析系统进行摄影并定量分析，实验重复3次。

2 结 果

2.1 人膝OA软骨细胞体外培养及鉴定结果 应用甲苯胺蓝染色形态学观察到OA软骨细胞为梭形、短梭形，具有较强的折光性，胞核为圆形或椭圆形(见图1)， 符合软骨细胞的形态特征。

图1 人膝OA软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定结果

2.2 人膝OA软骨细胞体外培养活力检测结果 见表1、图2。

表1 人膝OA软骨细胞体外培养活力检测结果 ±s

注：a为对照组，b、c、d、e、f分别为膝痹康0.016、0.08、0.4、2.0、10.0mg/mL

图2 人膝OA软骨细胞体外培养活力检测结果

由表1、图2可见，膝痹康在0.016～10.0mg/mL的浓度范围对OA软骨细胞在波长=450nm处24h的OD有影响，在此范围内不同浓度的膝痹康在24h对OA软骨细胞OD无明显差异(P>0.05)。

2.3 4组OA软骨细胞凋亡率结果 根据膝痹康对OA软骨细胞体外培养活力的影响实验结果，选择其在0.4～2.0 mg/mL的范围内设置0.5、1.0、2.0 mg/mL 3个剂量，作用24 h进行凋亡的实验研究。OA软骨细胞经TUNEL 标记后的结果见表2、图3。

表2 4组OA软骨细胞凋亡率结果 ±s

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与膝痹康低剂量组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与膝痹康中剂量组比较，#P<0.05

图3 4组OA软骨细胞凋亡率结果

由表2、图3可见，与对照组相比，膝痹康低剂量组细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)，膝痹康中、高剂量组下降(P<0.05，P<0.01)。膝痹康低、中、高剂量组间比较显示，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4 4组OA软骨细胞凋亡基因表达结果 见表3、图4。

表3 4组OA软骨细胞凋亡基因表达结果 ±s

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与膝痹康低剂量组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与膝痹康中剂量组比较，#P<0.05

图4 4组OA软骨细胞凋亡基因表达结果

由表3、图4可见，与对照组相比，膝痹康低剂量组Bcl-2、Bax及p53 mRNA相对表达量无明显变化(P>0.05)，膝痹康中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量明显上调(P<0.05)，Bax及p53 mRNA表达量明显下调(P<0.05，P<0.01 )。与膝痹康低剂量组相比，膝痹康中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量明显上调(P<0.05)，Bax及p53 mRNA表达量明显下调(P<0.05，P<0.01)；与膝痹康中剂量组相比，膝痹康高剂量组Bax mRNA表达量明显下调(P<0.05 )。

3 讨 论

膝骨关节炎是最常见的关节炎之一，是一种以退行性病理改变为基础的疾患[8]。多发于中老年人群，其症状多表现为膝关节红、肿、痛，上下楼梯痛、坐起立行时膝部痠痛不适等，也会有患者表现为关节肿胀、弹响、积液等，如不及时治疗，则会引起关节畸形、残废。目前膝骨关节炎的中医临床治疗及实验研究多集中在补益肝肾及活血通络两大方面[9-10]。长期以来，吴门医派治疗本病积累了丰富的临床实践经验，全国名老中医龚正丰教授认为本病虽属痹证范畴，却与风寒湿痹不尽相同，其成因复杂，为虚实夹杂之证，痰、湿、瘀均为重要的致病因素，故论治时以祛邪为主，并重视化痰祛湿、活血通络，尤其是对于辨证属湿注关节或痰瘀交阻者尤为适宜。化痰除湿祛瘀法是龚正丰教授临床治疗膝骨关节炎的重要方法[11]，而利用现代医学技术手段阐明此法的效用机制亦为重要。

化痰除湿祛瘀剂“膝痹康”方中天南星药性燥烈，其辛开走窜之力尤强，专走经络，善治经络风痰，是治疗痰、风、结、肿之良药，炮制可减轻其毒性，具有燥湿化痰、除经络中痰湿、止痛的作用；川乌祛风除湿，温经通络，可除寒湿结聚之湿痰死血，为治疗关节痹痛之要药，与天南星配伍可化痰祛风，通络止痛；薏苡仁利水渗湿，兼能健脾，功似茯苓，又能舒筋络，缓挛急，治疗风湿痹痛湿邪偏盛者；刺五加补益脾肾，祛风除湿，与薏苡仁相配，具有利水渗湿、健脾除痹的作用；丹参活血祛瘀，凉血养血，是平和的活血化瘀良药，其性微寒，可佐制天南星、川乌燥烈之性；地龙能活血化瘀，祛痰除湿，通剔经络，加强活血化瘀通络的作用。诸药合用，共收化痰除湿、活血通络之效。前期临床试验表明，膝痹康有改善膝骨关节炎临床症状的功能，如患者的步行能力、日常活动、疼痛、压痛、肿胀、活动受限、关节积液等，未出现明显不良反应[12]。动物实验提示，膝痹康可以明显减轻膝骨关节炎兔关节软骨和滑膜的病理损伤，对软骨及滑膜退变有较好的延缓作用，并可以通过抗炎、消肿、镇痛等作用以减轻关节肿胀和改善疼痛步态；膝痹康可通过降低血液和关节液中炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平，以抑制氧自由基及一氧化氮(NO)对软骨细胞及基质的破坏作用，达到延缓软骨退变的目的[13-14]；另外膝痹康可通过抑制关节软骨及滑膜组织中MMP-1、MMP-3 mRNA的表达水平升高而减轻关节软骨细胞外基质的降解，减缓关节软骨的进行性破坏[15-16]。

近年来，研究显示OA患者软骨细胞有细胞凋亡(apoptosis)的现象。目前研究发现在骨关节炎发病的各个阶段以及各种组织和细胞的病理改变中，软骨细胞凋亡在OA的发病过程中起着关键作用，并且软骨细胞凋亡的数量与OA的病程、病变程度具有高度一致性[17]。凋亡是调控关节软骨生长发育、控制软骨细胞功能状态、维持关节内微环境稳定必需的生理性过程[18-19]，多用以清除无功能、受损害、衰老的细胞，正常的软骨细胞中亦可见凋亡现象，但很少被检出，一般多存在于软骨表层[20]。过度凋亡则是病理性的和有害的，并被认为是OA发病的重要机制之一。因此，课题组选择目前认可的体外培养的OA患者的关节软骨细胞作为研究的细胞模型。细胞凋亡是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程，是细胞生理性死亡的普遍形式，是真核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制而发生的细胞自然死亡过程。细胞凋亡的发生使特定的细胞群体在特定的时间和特定的部位死亡，与细胞有丝分裂相互协调以维持细胞群体相对衡定，从而保障细胞数量以及形态和功能的平衡[21]。本研究结果提示，膝骨关节炎患者体外培养的膝骨关节软骨细胞凋亡明显增多，可见其增殖、凋亡的动态平衡被打破。膝痹康中、高剂量与对照组比较，凋亡率明显下降，凋亡率与膝痹康的剂量可能成负性剂量依赖性的关系。初步证明了膝痹康在一定剂量范围内存在拮抗OA软骨细胞过度凋亡的作用，可能延缓了关节软骨的退变。

细胞凋亡受基因严密的控制，其中Bcl-2家族在凋亡过程中起着关键的作用，是目前研究已知的最重要的抑制凋亡因子。Bax和Bcl-2基因有40%的同源性，但它们的作用却完全相反，是一对正负调节因子，Bcl-2/Bax的比值与决定细胞受到刺激信号后是否存活相关，Bcl-2/Bax比值升高，则抑制细胞凋亡，反之则促凋亡。研究证实，在细胞凋亡异常的疾病中存在着Bcl-2/Bax比例的异常，即促凋亡因子Bax和凋亡抑制因子Bcl-2两者失衡[22]。另一方面Bax和p53 mRNA直接相互作用，使Bax多聚化，诱发各种促凋亡因子的释放，导致细胞凋亡[23]。本研究结果显示，膝痹康在一定剂量范围内能显著地上调Bcl-2 mRNA的表达，下调Bax和p53 mRNA的表达，推测其抑制细胞凋亡的发生，可能是阻断了其内部自身凋亡机制的启动。

本研究结果从细胞生物学角度初步观察了膝痹康对膝骨关节炎的可能作用机制，表明膝痹康在防治膝骨关节炎方面具有潜在的基础研究价值。但由于本研究只是初步研究，力图拓展扩大临床病例观察，探索可靠的临床疗效以及更深层次的作用机制。

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(本文编辑：曹志娟)

Effects of Xibikang preparation of eliminating dampness and phlegm and blood stasis on apoptosis regulated genes expression of chondrocytes in patients with knee osteoarthritis

MENGXiangqi*,LIANGGuoqiang,YOUJunyi,etal.

*DepartmentofOrthopedicSurgery,SuzhouCityHospitalofTraditionalChineseMedicineinJiangsuProvince,Jiangsu,Suzhou215003

Objective To observe the effects of Xibikang preparation of eliminating dampness and phlegm and blood stasis the expression of apoptosis regulated genes in human knee osteoarthritis (OA) chondrocytes. Methods The chondrocytes originatef from cartilage tissue in knee OA patients after total knee replacement, which were cultured by enzyme digestion, cellular sources were identified by toluidine blue staining. The chondrocytes were divided into control group and Xibikang 0.016, 0.08, 0.4, 2.0, 10.0 mg/mL groups, the cellular proliferation in each group was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) after 24 h training. The chondrocytes were divided into control group and Xibikang low, medium and high dose groups (0.05, 0.1, 2.0 mg/mL) according to cell proliferation, the cellular apoptosis was detected by TdT-mediated Dutp nick end labeling (TUNEL), the expressions of B-cell lymphoma-2(Bcl-2) and Bcl-2-associated X protein (Bax) and p53 mRNA were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results This study successfully established a human osteoarthritis chondrocytes limited cell line, with normal growth condition, all cells originating from mesoderm chondrocytes which proved by toluidine blue. Xibi kang (range from 0.016 to 10.0 mg/mL) had effect of 24 h optical density in OA chondrocytes (ware length=450 nm). There was no statistical difference on apoptosis rate between low dose group and control group (P>0.05), but that in medium and high dose groups were decreased (P<0.05). There were significant differences on apoptosis rate through pairwise omparision among low, medium and high dose groups (P<0.05). As compared with control group, there were no significantly changes on the relative transcript level of Bcl-2, Bax and p53 mRNA in low dose group (P>0.05), the Bcl-2 mRNA was significantly up-regulated in medium and high dose group (P>0.05), and the Bax and p53 mRNA were significantly down-regulated (P<0.05，P<0.01). As compared with low dose group, the relative transcript level of Bcl-2 mRNA was significantly up-regulated in medium and high dose group (P>0.05), the Bax and p53 mRNA were significantly down-regulated (P<0.05，P<0.01). As compared with medium dose group, the relative transcript level of Bax mRNA was significantly down-regulated in high dose group (P<0.05). Conclusion Xibikang preparation of eliminating dampness and phlegm and blood stasis can regulate the expression of apoptosis genes, suppress the excessive apoptosis of chondrocytes, which may be one of the important mechanisms to inhibit cartilage destruction.

Osteoarthritis; Resolving phlegm; Apoptosis; Bcl-2-associated X protein; Bcl-2; Gene; p53

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.01.025

※ 项目来源：江苏省苏州市科技局2014年度第十五批科技发展计划(应用基础研究·医疗卫生)项目(编号：SYS201420)

孟祥奇(1972—)，男，主任中医师，博士。研究方向：脊柱及四肢骨折的中医治疗和现代手术治疗、骨关节疾病及颈肩腰腿痛等疾病的中医治疗。

R684.3；R349.53

A

1002-2619(2017)01-0094-07

2016-08-18)

△ 通讯作者：江苏省苏州市中医医院骨伤科，江苏 苏州 215003

1 吴门医派研究院，江苏 苏州 215003