CGRP对UUO小鼠肾组织间质纤维化与炎性因子表达的干预作用

刘丽辉 石亮 王岩 谷昆峰 崔素娅 宋铁鹰

·论著·

CGRP对UUO小鼠肾组织间质纤维化与炎性因子表达的干预作用

刘丽辉 石亮 王岩 谷昆峰 崔素娅 宋铁鹰

目的 探讨CGRP对小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型肾间质纤维化的影响。方法 选择雄性小鼠36只，建立小鼠UUO模型，前2 d治疗组和模型组分别每天给予CGRP 1.0 nmol·kg-1·d-1和同等量0.9%氯化钠溶液静脉注射。观察模型第14天肾小管损害百分比、肾间质纤维化程度、肾间质α-SMA平滑肌肌动蛋白、肾间质巨噬细胞数，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)以及F4/80 mRNA的表达。结果 CGRP显著减轻肾小管损害和肾间质纤维化(P<0.05)；治疗组肾间质巨噬细胞数F4/80和肾间质α-SMA表达显著低于模型组 (P<0.05)；CGRP显著抑制MCP-1以及F4/80mRNA的表达(P<0.05)。结论CGRP减少小鼠UUO模型肾间质巨噬细胞浸润、降低MCP-1以及F4/80mRNA表达、抑制α-SMA的表达，从而减轻肾间质纤维化。

CGRP；单侧输尿管梗阻模型；肾间质纤维化；巨噬细胞

进展性肾损害的重要病理特征是肾间质组织炎性改变及纤维化改变，肾小球滤过率与肾小管间质病损程度呈负相关，且对预后的判断比肾小球病变更有价值。因此，有效地抑制肾间质炎症和纤维化可减缓肾脏疾病的进展[1,2]。降钙素基因相关肽 (CGRP) 是一种迄今公认的最强的内源性舒血管多肽[3]，通过提高肾小球毛细血管超滤系数，抑制肾血管细胞收缩和改善对肾脏微循环，从而起到对保护肾脏的作用[4]，但未见相关文献报道其对肾间质组织细胞纤维化和炎症因子表达的影响。本实验拟通过小鼠单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型来研究CGRP对肾间质纤维化和炎性因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象 清洁级昆明小鼠(河北医科大学动物实验室提供，合格证号：SJL-F8-2015-5-9)36只，雄性，6～8周龄，体重(20±2)g。

1.2 试剂 CGRP(Catalog公司)，大鼠抗小鼠F4/80多克隆抗体(Abcam公司)，小鼠抗人α-SMA单克隆抗体(Dako公司),小鼠HRP二抗。

1.3 方法

1.3.1 实验分组和UUO造模方法： 将实验小鼠随机分成假手术组、模型组和CGRP治疗组，每组12只。模型组和CGRP治疗组小鼠以乙醚麻醉后，行左侧输尿管结扎术，而假手术组仅游离左侧输尿管,不结扎[5]。

1.3.2 给药方法：CGRP治疗组静脉注射 CGRP 1.0 nmol·kg-1·d-1，而假手术组、模型组给予同等量0.9%氯化钠溶液静脉注射。

1.3.3 标本收集：在UUO术后14 d处死3组小鼠后取术侧肾组织。一半置应用4%多聚甲醛固定后用作病理切片检查和免疫组化实验；另一半置于液氮中冷冻保存，以备提取总RNA，用于荧光实时定量 PCR(RT-PCR)检测。

1.3.4 肾组织 HE染色病理形态学观察：将4%多聚甲醛固定液固定的肾组织常规石蜡包埋切片，经HE染色后，光镜下观察肾小管间质的病理改变。对肾小管损害程度采用百分比评分法进行评估，计算20个以上高倍视野(×400)肾皮质中发生损害(肾小管扩张、萎缩、管型、坏死或小管炎)的肾小管数目和总肾小管数，以损害的肾小管数占总肾小管数的百分比表示。

1.3.5 肾组织Masson染色病理观察：取肾组织用4%多聚甲醛固定后常规石蜡包埋切片，经Masson染色，光镜下观察肾小管间质的病理改变；采用北京航天大学医学图像采集及分析系统，光镜(×200)下采集 Masson 染色肾脏病理图像，蓝色为纤维化阳性染色区。每张切片随机采集5个不重叠视野，测量每个视野中肾小管间质纤维化阳性染色的相对面积，取平均值。肾小管间质纤维化相对面积=肾小管间质纤维化阳性(蓝色)面积/整个视野面积。

2 结果

2.1HE染色 光镜下观察可见：模型组小鼠肾小管发生程度不一的膨胀,部分小管和间质的组织结构消失。肾小管上皮组织细胞水肿、空泡样变性，部分凋亡脱落；模型组肾间质细胞面积占总面积的比值与假手术组相比显著增加 (P<0.01)。而CGRP治疗组可显著改善上述病理变化(P<0.05)。见表1，图1。

表1 3组肾小管间质损害、肾间质纤维化和巨噬细胞积聚 ±s

注：与假手术组比较，*P<0.05,#P<0.01；与模型组比较，△P<0.05,☆P<0.01

2.2Masson染色 结果显示：模型组小鼠肾小管间质纤维化与假手术组相比显著增高(P<0.01)，而CGRP治疗组肾小管间质纤维化相对面积显著减少(P<0.05)(见表1和图1B)。免疫组化显示，在假手术组小鼠除血管外的肾小管间质组织和肾小球组织中，几乎无α-SMA蛋白的表达；模型组小鼠肾组织中的α-SMA阳性染色主要积聚于肾小管间质，而肾小球内则不明显(P<0.01)。且模型组小鼠肾小管间质中α-SMA阳性染色明显高于CGRP治疗组(P<0.05)。见表1,图2。

2.3UUO模型建立14d后，肾间质有大量巨噬细胞浸润，在肾小管间质病损处可见浸润巨噬细胞明显积聚，而假手术组仅偶见少数巨噬细胞(P<0.01)。CGRP治疗组肾间质巨噬细胞浸润显著受抑制，巨噬细胞数明显低于模型组(P<0.05)。见表1，图2。

2.4F4/80、MCP-1mRNA在假手术组的小鼠肾组织几乎无的表达，而在模型组小鼠明显上调(P<0.05或<0.01；而经过CGRP治疗后MCP- 1mRNA的表达较模型组显著下调(P<0.05或<0.01)。见图3、4。

图1 UUO模型；A，HE染色；B,Masson染色；从左到右分别为假手术组，治疗组以及模型组

图2UUO模型；A，α-SMA免疫组化染色；B,F4/80免疫荧光染色法；红色代表F4/80巨噬细胞，蓝色代表DAPI核染色；从左到右分别为假手术组，治疗组以及模型组

3 讨论

各类炎症性肾脏疾病进展为终末期肾衰竭的最后共同过程是肾小管间质组织细胞的损害,主要征象为肾小管损害和巨噬细胞对间质组织的浸润,并最终发展为肾间质纤维化。肾间质纤维化(RIF)是涉及多种生物活性物质参与、肾固有及间质细胞参与、细胞外基质生成/降解失调等多因素的病理过程，近期研究实验证明,在早期肾小管上皮细胞在受损或受激惹后,多种黏附、趋化及生长因子等被激活表达,通过对多核白细胞、巨噬细胞和T细胞等积聚，对肾间质细胞造成直接或间接的损害,同时细胞因子之间的协同作用可以让更多的炎性反应过程发动，最终导致肾间质细胞纤维化，这其中巨噬细胞发挥了显著作用。巨噬细胞虽然归属于免疫细胞，但其活化后分泌多种具有生物活性物质参与调控这一过程。根据细胞功能的不同可将巨噬细胞分为两种，即分泌肿瘤坏死因子α、白介素-1β、γ-干扰素等促炎型细胞因子的M1型巨噬细胞；分泌IL-10、IL-13、TGF-β、血管内皮细胞生长因子、结缔组织生长因子、血小板源性生长因子等抑炎及促修复的M2型巨噬细胞。根据M2功能不同，进一步又分为M2a、M2reg两种，M2a起着促进组织修复功能同时造成组织纤维化，M2reg则起着抑制组织炎症功能。研究表明在RIF疾病早期，以M1为主，随病程延长M2渐增多。Fujiu等[6]对单侧输尿管结扎模型小鼠研究发现，肾间质中M1数量与RIF程度正相关。特殊的肾间质微环境介导巨噬细胞表型转化及巨噬细胞分泌多种生物学活性物质诱导肾固有细胞损伤、EMT、ECM生成/降解失调，对其中任何一个环节的干预可能为延缓RIF进展治疗靶点，采用不同手段抑制巨噬细胞浸润可减轻肾损害和纤维化[1,7]。

图3 UUO模型各组F4/80表达比较

图4 UUO模型各组MCP-1 mRNA表达比较

CGRP是一种生物活性肽，由37个氨基酸组成，组织中钙离子的存在，是CGRP的释放的依赖因素，当各种生化或理化因素刺激神经末梢时，位于神经末梢和细胞膜表面的“辣椒素受体”被激活，引起细胞外钙离子流入细胞膜内，钙离子在细胞内的浓度因此提升,进而诱导释放CGRP。CGRP在人体内主要以一种神经递质的形式存在，并在心血管系统和神经系统中主要分布。在血管系统中,在所有血管的神经纤维中几乎都可发现CGRP存在，主要在动脉及静脉的主干、分支血管壁外膜分布表达，在血管壁外膜与平滑肌层之间CGRP神经纤维相互交织并包缠血管全程。此外，在泌尿生殖道组织、呼吸道组织以及消化道组织中，可见大量CGRP存在。在人体内，还有多种细胞具备合成降钙素基因相关肽的功能，例如：嗜酸性粒细胞、内皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞、朗格汉细胞以及淋巴细胞等。CGRP仅仅在与CGRP受体相结合后，相应的生理学作用才能表达出来，其中多种调节蛋白的调节控制作用一直存在于这结合过程之中。截至目前为止，大量研究发现，在人体血管系统、呼吸道、胃肠组织、肾脏组织及骨骼肌等系统组织中，有大量CGRP受体表达存在。研究证明，CGRP受体亦存在于人及鼠的肺泡巨噬细胞和外周巨噬细胞的胞膜上，CGRP与CGRP受体结合后，小鼠巨噬细胞被激活后产生肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、IL-12亦被抑制，并双相调节IL-6的生成[8]。早期的研究表明，降钙素基因相关肽可以抑制巨噬细胞等炎性细胞的浸润，降低炎症性介质的表达[9]，还可以抑制肝纤维化进展[10]。CGRP作为目前已知的扩血管作用最强的内源性扩血管物质，其扩张血管的效果比异丙肾上腺素大10～100倍，比5-羟色胺、ATP、乙酰胆碱和P物质至少高1 000倍。在机体不同脏器组织中，血液能不断重新分配流动，就依赖于CGRP强大的扩血管作用。动脉粥样硬化病变进展过程中，CGRP在病变早期对动脉粥样硬化的发生发展起到抑制作用，甚至逆转作用，均依赖于CGRP对血管平滑肌的增殖的抑制作用,以及对血管内皮细胞的损伤的修复作用[11]。另有研究检测表明，在同种异体器官移植术后，移植器官血管组织中CGRP表达水平增高，对炎症细胞、炎症因子的浸润起到明显抑制作用，减轻移植后血管细胞损害，抑制细胞凋亡，从而保护移植器官存活[12]。对缺血一再灌注造成的肾小球毛细血管内皮和肾小管上皮的损伤的修复和保护作用，提示CGRP可以作为治疗ARF的有益药物。

本研究采用经典的单侧输尿管结扎(UUO) 致小鼠肾间质纤维化模型。通过光镜下观察发现肾小管组织发生不同程度的膨胀，部分小管和间质的组织结构消失。肾小管上皮组织细胞水肿、空泡样变性，部分凋亡脱落；而CGRP治疗组可在一定程度上改善上述病理变化，CGRP的治疗可以显著减轻肾损害。肌成纤维细胞在在纤维化过程中发挥关键作用，其标记蛋白是α-SMA。在人体肾脏组织中发现肾小管间质内α-SMA表达量与间质纤维化程度及肾功能恶化程度呈正相关[13]，而在UUO鼠模型中也发现术后3dα-SMA表达明显增多[14]。因此，α-SMA可作为评价肾间质细胞组织纤维化分级程度的重要指标之一。肾间质表达α-SMA是肾间质纤维化的重要指标[15]。通过Masson染色和α-SMA免疫组化染色，我们发现CGRP能够明显抑制肾间质纤维化形成和α-SMA表达，这表明CGRP可能通过抑制肾间质肌成纤维细胞聚集和细胞外基质合成来抑制肾间质组织纤维化。UUO模型建立14d后，肾间质有大量巨噬细胞浸润；在肾小管间质损害处，主要有浸润巨噬细胞积聚，F4/80是巨噬细胞的表面标志，巨噬细胞浸润与肾脏固有细胞表达MCP-1增加有密切关系，通过F4/80的免疫荧光染色，我们发现，CGRP抑制肾脏巨噬细胞F4/80浸润，同时还可以显著下调肾组织F4/80和MCP-1的mRNA表达。CGRP治疗组显著抑制肾间质巨噬细胞浸润。

本研究首次通过小鼠UUO模型证明CGRP能减少肾组织中F4/80和MCP-1mRNA的表达、抑制肾间质巨噬细胞浸润，减轻肾间质纤维化，提示CGRP在肾间质纤维化的治疗中有着不可忽视的应用前景。

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Intervention effects of CGRP on renal interstitial fibrosis and expression of inflammatory cytokines in mice with unilateral ureteral obstruction

LIULihui*,SHILiang,WANGYan,etal.

*DepartmentofUrinarySurgery,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on renal interstitial fibrosis and expression of Inflammatory cytokines in mice with unilateral ureteral obstruction (UUO).Methods The animal models with UUO were established in 36 mice.The mice in treatment group were given CGRP 1.0nmol·kg-1·d-1by intravenous injection,however,the mice in model group were given equivalent 0.9% sodium chloride solution by intravenous injection. The mice in both groups were sacrificed after 14-day administration,then the percentage of renal tubular lesion,the extent of renal interstitial fibrosis, number of renal interstitial macrophage cells, the expression levels of renal interstitial expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and F4/80 mRNA were observed and compared between two groups.Results CGRP alleviated significantly renal tubular lesion and renal interstitial fibrosis (P<0.05).The expression levels of α-SMA and macrophages number in renal interstitial in treatment groups were significantly lower than those in model group (P<0.05).MoreoverCGRPinhibitedsignificantlytheexpressionlevelsofMCP-1andF4/80mRNA(P<0.05). Conclusion CGRP can reduce macrophage infiltration of mice with UUO,decrease the expression levels of MCP-1 and F4/80 mRNA,inhibit the expression of α-SMA so as to relieve renal interstitial fibrosis.

calcitonin gene-related peptide；unilateral ureteral obstruction model; renal interstitial fibrosis; macrophages

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.04.016

050011 河北省石家庄市第一医院泌尿外科(刘丽辉),影像科(石亮),普外科(王岩),麻醉科(谷昆峰、崔素娅、宋铁鹰)

R

A

1002-7386(2017)04-0540-05

2016-10-15)