促红细胞生成素和氨甲酰化衍生物对慢性心力衰竭大鼠抗心肌细胞凋亡及机制的研究

黄兆琦 许卫 伍金雷 陈胜强 陈晞明

·论著·

促红细胞生成素和氨甲酰化衍生物对慢性心力衰竭大鼠抗心肌细胞凋亡及机制的研究

黄兆琦 许卫 伍金雷 陈胜强 陈晞明

目的 探究促红细胞生成素(EPO)及氨甲酰化抗慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的保护作用及其可能的机制。方法 将39只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、EPO组及CEPO组。所有大鼠均采用腹腔注射异丙肾上腺素法建立大鼠心力衰竭模型。干预4周后，检测3组大鼠血流动力学指标变化，血清中iNOS、SOD水平及心肌细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI)和心肌细胞凋亡率。结果 与对照组比较，EPO组与CEPO组LVSP、±dp/dtmax均显著提高，而HR及LVEDP显著下降，差异有统计学意义(P<0．05)；EPO组与CEPO组间血流动力学指标变化差异有统计学意义(P<0．05)；EPO组与CEPO组SOD水平与对照组比较显著上升(P<0．05)，而iNOS水平显著下降(P<0．05)；EPO组与CEPO组间iNOS、SOD水平差异有统计学意义(P<0．05)；3组大鼠心肌细胞凋亡指数以对照组最高(36.53%)，EPO组次之(23.73%)，CEPO组最低(19.64%)，心肌细胞凋亡指数差异有统计学意义(P<0．05)；3组大鼠不同时间点心肌细胞凋亡率按照对照组、EPO组及CEPO组的顺序依次降低，差异有统计学意义(P<0．05)。结论 EPO及CEPO可有效改善CHF大鼠的心功能，抑制心肌细胞凋亡CEPO的功效要优于EPO，其发生机制可能与机体内血清中的iNOS及SOD水平有关。

促红细胞生成素；氨甲酰化；慢性心力衰竭；机制

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种由肾脏和肝脏分泌的细胞因子，具有促进红细胞生成的作用。大量研究证实，EPO除了具有造血活性外，对机体多种组织器官(如心脏、肾脏及视网膜等)具有保护作用，可以减少相关组织器官的细胞凋亡、抑制炎性反应、以及促进血管生长和功能恢复[1]。但长期或者大剂量EPO使用可能会引发红细胞增多症、高血压及血栓形成等不良反应[1]。EPO经氨甲酰化而产生的衍生物—氨甲酰化促红细胞生成素(CEPO)，同样具有保护机体组织器官的作用，但却不表现任何促红细胞生成活性，因此可以有效避免高血压及血栓形成等不良反应。慢性心力衰竭(CHF)是临床上各种类型心脏病的最终结局，其主要发病机制是由于心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等引起的持续性的心肌损伤。众多实验已经证实了EPO及CEPO对心肌组织的保护作用[2]，但在CHF中的心肌保护作用相关报道较少。本文建立大鼠CHF模型，予以EPO及CEPO干预，以探究EPO及CEPO抗慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的保护作用及其可能的机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠100只，购于兰州大学医学实验动物中心(合格证号：44007200017850)，清洁级，体重(230±20)g。大鼠实验前适应环境1周，自由饮食，饲养室内温度为(23±2)℃，相对湿度65%，给予标准通风及照明条件[3]。实验过程中对动物的处置均符合动物伦理学标准。

1.2 主要试剂、药品 EPO：沈阳三生制药公司，规格10 000 U/ml；CEPO：Warren Pharmaceuticals公司；盐酸异丙肾上腺素注射液(ISO)：上海禾丰制药有限公司，规格1 ml/支；原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒：罗氏(Roche)公司；NOS(分型)测定试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；SOD测定试剂盒：北京博迈斯科技发展有限公司。

1.3 实验方法 将100只SD大鼠腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)5 mg/kg，1次/d，连续3 d造模[4]。喂养5周后，造模大鼠死亡15只，其中腹腔注射异丙肾腺素后前3 d分别死亡6、4、3只，之后5周时间内死亡2只。对存活的大鼠进行造模成功判定，以左心室舒张末压(LVEDP)≥15 mm Hg提示CHF模型构建成功[5]。经检测，共有46只存活大鼠的LVEDP<15 mm Hg，提示CHF模型构建失败。而除掉造模失败，术中及术后死亡的大鼠，共有39只大鼠造模成功。将造模成功大鼠随机分为对照组、EPO组、CEPO组，每组13只。EPO组予以50 μg/kg EPO腹腔注射，2次/周，持续4周；CEPO组予以腹腔注射CEPO 50 μg/kg[6]，2次/周，持续4周[7]；对照组予以腹腔注射50 μg/kg 0.9%氯化钠溶液。所有SD大鼠腹腔注射时均应注意回抽，避免进入血管、膀胱及肠管。持续干预4周后进行试验指标的测定。

1.4 检测指标 (1)干预4周后，于最后一次给药后禁食水12 h，称重，穿刺右侧颈总动脉，并植入内含0.1%肝素、直径1 mm、末端带有微压力传感器的聚乙烯导管，连接BL-410S生物机能实验系统，记录血流动力学指标，包括心率(HR)、LVEDP、左心室内压峰值(LVSP)、左心室内压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)[8]。(2) 血流动力学指标测定完成后，于右侧颈总动脉插管处留取血样本2 ml置于抗凝管中，室温静置15 min后于常温下3 000 r/min离心10 min，留取上清液，置于-70℃冰箱备用[8]。然后按照上海酶联生物科技有限公司的NOS(分型)测定试剂盒及北京博迈斯科技发展有限公司的SOD测定试剂盒说明分别检测血清中iNOS、SOD水平。(3)检测心肌细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI)和心肌细胞凋亡率。用TUNEL 试剂盒检测心肌细胞凋亡情况，具体方法：从已制成的石蜡切片中，各组随机取3张切片，按照 TUNEL 试剂盒操作方法检测心肌细胞凋亡，荧光显微镜下观察凋亡细胞荧光显色并采取图像，再进行 DAB 显色，每张切片在高倍镜(×400)下随机读取6个不重叠视野，以细胞核中有染成棕色为阳性细胞。计数后，计算细胞凋亡指数(AI)=单视野凋亡阳性细胞数/单视野总细胞计数×100%，取其平均值进行统计分析[9]；心肌细胞凋亡率的测定：选取相应部位，每片选分布均匀的5个视野作为观察区。采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件进行定量分析[10]。

2 结果

2.1 SD大鼠一般情况 对照组、EPO组及CEPO组各出现1只大鼠死亡，对照组死亡原因考虑为心力衰竭加重，而EPO组及CEPO组死亡大鼠经解剖后诊断死因为肠粘连；3组大鼠均先后出现精神不振、进食不佳、毛色枯泽甚至出现脱毛、口唇紫绀等心力衰竭症状，按照对照组、EPO组及CEPO组的顺序3组大鼠心衰症状总体上依次减轻。

2.2 血流动力学变化情况 与对照组比较，EPO组与CEPO组的LVSP、±dp/dtmax有了显著提高，而HR及LVEDP显著下降，差异有统计学意义(P<0．05)。见表1。

表1 3组大鼠血流动力学变化比较 ±s

注：与对照组比较，*P<0.05；与EPO组比较，#P<0.05

2.3 血清iNOS及SOD水平测定EPO组与CEPO组SOD水平与对照组比较有显著上升(P<0．05)，而iNOS水平显著下降(P<0．05)；EPO组与CEPO组iNOS、SOD水平差异有统计学意义(P<0．05)。见表2。

组别iNOSSOD对照组29．73±0．9844．23±3．74EPO组25．63±1．23∗47．35±3．56∗CEPO组22．23±1．51∗#51．95±3．42∗#

注：与对照组比较，*P<0.05；与EPO组比较，#P<0.05

2.4 心肌细胞凋亡率及凋亡指数情况 3组大鼠心肌细胞凋亡指数以对照组最高(36.53%)，EPO组次之(23.73%)，CEPO组最低(19.64%)，心肌细胞凋亡指数差异有统计学意义(P<0．05)；3组大鼠不同时间点心肌细胞凋亡率按照对照组、EPO组及CEPO组顺序依次降低，差异有统计学意义(P<0．05)。见图1，表3。

图1 3组心肌细胞凋亡指数比较(%)

表3 3组大鼠不同时间点心肌细胞凋亡率±s

注：与对照组比较，*P<0.05；与EPO组比较，#P<0.05

3 讨论

心脏功能的改变(如心脏收缩及舒张功能的异常、心脏供血供氧状况以及心室壁张力大小等)，可以从心肌细胞血流动力学指标的变化中反映出来。目前常采用一些速率指标来评价心肌收缩和舒张能力，如-dp/dtmax和LVEDP是心肌早期舒张功能改变的敏感指标。+dp/dtmax和LVSP常作为评价心肌收缩能力的重要指标[11]。本实验研究结果显示，与对照组比较，EPO组与CEPO组LVSP、±dp/dtmax有显著提高，而HR及LVEDP有显著下降。EPO及CEPO对反映心脏收缩功能的LVEDP、+dp/dtmax和反映心脏舒张功能的LVEDP、-dp/dtmax改善情况显著，提示EPO及CEPO可以有效加强心肌收缩力，降低舒张末期容积和压力，改善心脏血流动力学，进而改善机体心脏功能。并且，CEPO的效果明显优于EPO。而王锋等[8，11]的研究也与本研究结果类似。

有研究显示，EPO对心肌细胞的保护作用依赖于其抗凋亡的作用[12]。而本研究对各组大鼠心肌细胞凋亡情况的监测显示，各组大鼠心肌细胞凋亡指数以对照组最高，EPO组次之，CEPO组最低；不同时间点心肌细胞凋亡率按照对照组、EPO组及CEPO组的顺序依次降低。结果提示EPO及CEPO抗细胞凋亡的作用。张丽等[13]的研究也与本研究结果类似。此外，多数研究认为EPO及CEPO抗细胞凋亡作用与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、PKC、mltoKATP、酪氨酸激酶(JAK2)及一氧化氮合酶(NOS)等激活有关[14]。其中的一氧化氮合酶(NOS)是合成NO的关键酶之一。近些年研究发现，NO除了具有扩张血管、抗血小板聚集、粘附以及作为炎性介质和细胞毒性等作用，高浓度的NO能够抑制心肌收缩力，而低浓度的NO则能增加心肌收缩力。而合成NO的关键酶一氧化氮合酶(NOS)分为两型：原生型一氧化氮合酶(cNOS)和iNOS。本研究通过测定3组大鼠血清iNOS及SOD水平探究EPO及CEPO抗细胞凋亡可能的机制，研究结果显示，EPO组与CEPO组iNOS水平与对照组比较显著下降。王锋等[8]认为，慢性心力衰竭患者机体内iNOS含量较高，而cNOS含量降低，因此导致机体内NO含量明显升高。而高浓度的NO可损坏线粒体能量代谢，抑制细胞增殖，破坏心肌细胞内DNA结构，进而促进细胞凋亡；另一方面，由于NO的细胞毒性作用，细胞代谢活动受到影响，细胞呼吸链及酶的活性受到干扰，而使DNA降解的酶被激活，进而导致心肌细胞的凋亡，而心肌细胞的凋亡则会进一步恶化CHF。而杨丽霞等[15]的研究认为iNOS过度表达会导致产生大量NO，大量NO在胞浆内形成大量的过氧化硝酸亚盐，并最终形成激活多肽(ADP-核糖)聚合酶导致细胞凋亡。这些研究都证实了心肌细胞的凋亡与NOS不可分割的关系。

本研究监测的另一项指标SOD是体内清除OFR最主要的酶，而OFR可通过与细胞膜及细胞器膜的多价不饱和酸发生反应而导致细胞损伤。因此，当机体内OFR水平过高时，细胞的功能及结构会受到破坏，机体的代谢也会因此紊乱。尤其是过高的OFR还可损伤血管内皮细胞，使血管内舒张因子合成减少，活性减弱，进而加速CHF的进程[8]。本研究结果中EPO

组与CEPO组SOD水平与对照组比较显著上升，SOD含量水平越高，机体内OFR含量就会越低，细胞受到的损害及CHF进程也会因此减轻。实验中EPO组及CEPO组细胞凋亡率的降低以及相应血流动力学的改变也证实了这一点。

综上所述，本研究通过建立CHF大鼠模型，发现EPO及CEPO可有效改善CHF大鼠的心功能，抑制心肌细胞凋亡，其发生机制可能与机体内血清中的iNOS及SOD水平有关。但其抗凋亡作用机制较为复杂，仍需进一步精确验证与研究。

1 林雪梅,马玉姗.氨甲酰化的促红细胞生成素研究进展.华西医学,2007,22:678-679.

2MoonC,KrawczykM,PaikD,etal.Erythropoietin,modifiedtonotstimulateredbloodcellproduction,retainsitscardioprotectiveproperties.JournalofPharmacology&ExperimentalTherapeutics,2006,316:999-1005.

3 赵玉伟,李法琦,李万玉,等.促红细胞生成素对急性心肌梗死大鼠心脏的保护作用及抗凋亡信号机制.中国老年学杂志,2013,33:849-851.

4PeterK,JanaK,DanaK,etal.Isoproterenol-inducedheartfailureintheratisassociatedwithnitricoxide-dependentfunctionalalterationsofcardiacfunction.EuropeanJournalofHeartFailure,2009,11:140-146.

5TnnessenT,ChristensenG,OieE,etal.Increasedcardiacexpressionofendothelin-1mRNAinischemicheartfailureinrats.CardiovascularResearch,1997,33:601-610.

6FiordalisoF,ChimentiSL,BaiA,etal.Anonerythropoieticderivativeoferythropoietinprotectsthemyocardiumfromischemiareperfusioninjury.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2005,102:2046-2051.

7LiY,TakemuraG,OkadaH,etal.Reductionofinflammatorycytokineexpressionandoxidativedamagebyerythropoietininchronicheartfailure.CardiovascularResearch,2006,71:684-694.

8 王锋,张丽,崔丽君,等.氨甲酰化促红细胞生成素抗大鼠慢性心力衰竭的实验研究.山东医药,2011,51:31-33.

9 许卫,陈永权,伍金雷,等.促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞的抗凋亡作用及对AKT蛋白表达的影响.天津医药,2016,44:63-66.

10 马宝新.促红细胞生成素及其衍生物抗癫痫大鼠心肌细胞凋亡及机制的研究.吉林大学学报,2009,35:55-56.

11 范春兰,余迎梅,张彦卓.葶苈子提取液对CHF大鼠血流动力学和血浆AngⅡ、ALD水平的影响.中国民族民间医药,2009,18:8-9.

12MoonC,KrawczykM,AhnD,etal.Erythropoietinreducesmyocardialinfarctionandleftventricularfunctionaldeclineaftercoronaryarteryligationinrats.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100:11612-11617.

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14 王华军,江慧琳,陈晓辉,等.促红细胞生成素对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的抗凋亡作用及机制研究.中国危重病急救医学,2010,22:302-305.

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Study on the protective effects and possible mechanism of erythropoietin and carbamoylation on cardiomyocytes apoptosis of rats with chronic heart failure

HUANGZhaoqi,XUWei,WUJinglei,etal.

DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China

Objective To investigate the protective effects and possible mechanism of erythropoietin (EPO) and carbamoylation on cardiomyocytes apoptosis of rats with chronic heart failure (CHF).Methods Thirty-nine healthy male SD rats were randomly divided into control group,EPO group and CEPO group.The animal models with heart failure were established by intraperitoneal injection with ISO-epinephrine in all the rats.After 4-week intervention,the changes of hemodynamic parameters,the serum levels of iNOS and SOD as well as apoptotic index (AI) and apoptosis rate of myocardial cells were detected and calculated.Results As compared with those in control group, LVSP and ±dp/dtmax in EPO group and CEPO group were significantly increased,however, HR and LVEDP were significantly decreased (P<0.05).ThereweresignificantdifferencesinhemodynamicparametersbetweenEPOgroupandCEPOgroup(P<0.05).Ascomparedwiththoseincontrolgroup,SODlevelsinEPOgroupandCEPOgroupweresignificantlyincreased(P<0.05),however,iNOSlevelsweresignificantlydecreased(P<0.05).ThereweresignificantdifferencesiniNOSandSODlevelsbetweenEPOgroupandCEPOgroup(P<0.05).Amongthethreegroups,theAIincontrolgroupwasthehighest(36.53%),thenextinorderEPOgroup(23.73%),whichinCEPOgroupwasthelowest(19.64%),therewasasignificantdifferenceinAIamongthethreegroups(P<0.05).Moreoverthedecreaseorderofapoptosisrateindifferenttimepointswascontrolgroup,EPOgroup,CEPO(P<0.05).Conclusion The EPO and CEPO can effectively improve the cardiac function of rats with CHF,and the inhibition efficiency of CEPO is superior to that of CPO,and its action mechanism may be related to the changes of serum levels of iNOS and SOD.

erythropoietin; carbamoylation; chronic heart failure; mechanism

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.04.001

项目来源：广东省科学技术研究与发展指导计划项目(编号：2013B022000103)

510150 广州市，广州医科大学附属第三医院心内科(黄兆琦、许卫、伍金雷、陈晞明)；广州医科大学附属第二医院(陈胜强)

R 541.6

A

1002-7386(2017)04-0485-04

2016-08-10)