细胞免疫组化法筛选口蹄疫病毒单克隆抗体的研究

张燕红 路荣 刘国英 范秀丽 任旭荣 张妍/金宇保灵生物药品有限公司

细胞免疫组化法筛选口蹄疫病毒单克隆抗体的研究

张燕红 路荣 刘国英 范秀丽 任旭荣 张妍/金宇保灵生物药品有限公司

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的偶蹄兽的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病感染途径多、传播速度快，严重危害畜牧业的发展和国际经济贸易的流通，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类疾病，该病为必须上报的疾病。我国也将其列为一类传染病，并列为国家强制性免疫的动物疫病之一。根据口蹄疫血清型不同，口蹄疫病毒分为O、A、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ、AsiaⅠ七个型血清型，且各个血清型间没有交叉保护力，每个血清型又有很多亚型，型内不同毒株间的变异可导致抗原差异，这为口蹄疫的诊断和预防带来了极大的困难。

1975年，科学家建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成细胞杂交瘤。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体，简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

1982年，科学家首次研究成功抗O型FMDV单抗以来，世界许多国家已先后研制出多株针对各种血清型的单克隆抗体。目前FMDV单克隆抗体主要应用于FMDV抗原位点的分析与定位、FMDV受体结合位点的研究、FMDV抗原结构与生物学功能相关性研究、鉴定并跟踪病毒株抗原变异等方面，同时，FMDV单抗还可以根据流行毒株的中和单抗谱，从疫苗毒中选择出相近毒株，应用于免疫预防中。针对疫苗株的单克隆抗体，也可用于对疫苗质量进行评估。

一、材料

1.病毒。O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/ JMS、O/OZK-93、O/OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株病毒液，由金宇保灵生物药品有限公司提供。

2．细胞培养。24～48 h的单层BHK-21细胞，由金宇保灵生物药品有限公司提供。

3．细胞培养基。MEM（宜兴市塞尔生物科技有限公司），加入10%胎牛血清（Hyclone公司）。

4．1．2%GUM胶。将3．6 g GUM胶粉加至300 ml沸水中，用搅拌器混匀，116℃、20分钟高压灭菌，冷却后冷藏保存。

5．GUM胶培养基。1．2% GUM胶（aladdin）+2XMEM（体积比为1∶1），由金宇保灵生物药品有限公司按说明书配制。

6．固定液的配制。甲醇（北京化工厂），丙酮（天津市富宇精细化工有限公司），（体积比为1∶1），置于-20℃保存。

7．其他试剂。1%马血清PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）、一抗（7G3、2B4、3D7、2B5），均由金宇保灵生物药品有限公司提供；二抗（羊抗鼠）购自sigma公司；Vector VIP substrate kit for peroxidase试剂盒（货号：SK-4600），购自美国Life Technologies公司。

二、方法

1.细胞培养。将BHK-21细胞悬液加入到六孔板中，每孔加2ml，培养24h长满单层。

2.稀释病毒。将O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/JMS、O/OZK-93、O/OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株病毒液按照10-4、10-5、10-6滴度进行稀释。将稀释后的毒液加入已长满单层BHK细胞的六孔板中，每个滴度2个复孔，每孔加200μL病毒液，置于37℃吸附1小时，期间要振摇几次，使病毒与细胞充分结合。

3.病毒培养。每孔加入2 mL GUM胶培养基，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养36～48 h（中间不要晃动）。

4．细胞固定。弃掉GUM胶培养基，用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）清洗1～2次，每孔再加入1．5 ml固定液，置于-20℃固定2 h。

5．封闭。弃掉固定液，每孔加入1．5 ml的含1%马血清PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）进行封闭，置于37℃封闭1 h。

6．稀释单抗。（用1%马血清稀释）

表1 单抗稀释方法

7．弃掉封闭液，每孔加入1．5 ml稀释好的单抗，置于37℃培养40 min或者室温（25℃） 1 h。8．弃液，用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）清洗三次。9．用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）稀释二抗至1∶2 000。

10．每孔加入1 ml稀释好的二抗置于37℃培养30 min。

11．弃液，用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）液清洗3次。

12．显色利用显色试剂盒，按照试剂盒使用说明书进行操作，10min后显微镜下观察染色情况。

三、结果

1．7G3、2B4抗体与O/GX/09-7株病毒液发生显色反应，与O/Mya98/XJ/2010、O/JMS、O/OZK-93、O/OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株均不发生显色反应；

图1 左图为2B4单抗与O/GX/09-7株显色反应，右图为7G3与O/GX/09-7株显色反应。

2．3D7、2B5抗体与O/Mya98/XJ/2010株病毒液发生显色反应，与O/GX/09-7、O/JMS、O/OZK-93、O/ OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株均不发生显色反应。

图2 左图为2B5单抗与O/Mya98/XJ/2010株显色反应，右图为3D7与O/GX/09-7株显色反应。

四、讨论

自1982年 McUcllogh等首次研制出抗O型单克隆抗体以来，世界上许多国家先后研制出多株针对各型的单克隆抗体，我国也有研究制备型单克隆抗体的报道[7]，但是，FMDV具有多个抗原位点，每个位点又含有许多表位，因此获得更多的O型FMDV单克隆抗体，对于寻求具有诊断价值的单克隆抗体，以及鉴定保护性抗原表位，是必要的。1990年Maanen等用针对O、A和C型FMDV不同表位的单克隆抗体各2株，建立了一种复合捕获阻断ELISA，用于检测O、A、C型FMDV，应用试验结果显示该方法具有敏感、特异、快速等优点，可用于牛FMD疫苗免疫效力试验中免疫应答效果的评价。目前，间接夹心ELISA是OIE的世界口蹄疫参考实验室检测FMDV抗原和病毒血清型时推荐使用的方法。然而FMDV单克隆抗体多应用于研究和确定目标的检测，尚未广泛应用于诊断和检疫中，因此需要利用单克隆抗体开发更简便、更廉价、更准确的诊断方法。可以预期，本研究制备的4株O型FMDV特异性单抗，将在的研究和防制中发挥重要的作用。

本试验通过杂交瘤技术获得3株稳定分泌抗型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经生物学特性鉴定，均为特异性针对O型FMDV的单抗。其中，7G3抗体与O/ GX/09-7株病毒发生特异性反应，3D7、2B5抗体只与O/Mya98/XJ/2010株病毒发生特异性反应，而2B4抗体在高浓度时与O/Mya98/XJ/2010株病毒有交叉反应，该抗体与MYA98有微弱的交叉反应，但仍可作为ELISA抗原检测的包被抗体。

（略）