西格列汀对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞PDX-1 mRNA表达的影响

郑坤杰，武 革，耿建林，吴美芬，方 烁

(1河北省衡水市哈励逊国际和平医院内分泌科，衡水 053000；2广东医科大学附属医院内分泌科；*通讯作者，E-mail：wuge427427@126.com)

西格列汀对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞PDX-1 mRNA表达的影响

郑坤杰1，武 革2*，耿建林1，吴美芬2，方 烁2

(1河北省衡水市哈励逊国际和平医院内分泌科，衡水 053000；2广东医科大学附属医院内分泌科；*通讯作者，E-mail：wuge427427@126.com)

目的 观察西格列汀对2型糖尿病大鼠糖脂代谢及胰岛β细胞胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)mRNA表达水平的影响。 方法 将60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组及西格列汀组。正常对照组给予普通饲料喂养，糖尿病模型组与西格列汀组给予高脂饲料喂养，于第8周末以链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)30 mg/kg腹腔注射，成模后西格列汀组给予西格列汀100 mg/kg灌胃，每日1次，共持续4周。其余两组予等量的生理盐水灌胃。HE染色观察胰岛细胞组织学改变，以实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠胰腺胰岛细胞PDX-1mRNA的表达。 结果 与正常对照组比较，治疗前模型组及西格列汀组空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)增高，胰岛素敏感指数(ISI)、PDX-1 mRNA的表达量明显减低(P<0.01)。与治疗前比较，西格列汀治疗后2型糖尿病大鼠FBG、FINS、TG、TC下降(P<0.01)，ISI明显升高(P<0.01)。与模型组比较，西格列汀组胰腺PDX-1 mRNA的表达量可明显增高(P<0.01)。 结论 西格列汀可上调2型糖尿病大鼠胰岛β细胞PDX-1基因的表达。

西格列汀； 糖尿病； 胰岛β细胞； 胰腺十二指肠同源盒-1； 大鼠

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种肠肽类激素，其作用的多效性在糖尿病治疗领域已显示了广阔应用前景。西格列汀是二肽基肽酶-4(dipeptidylpeptidase-4,DPP-4)抑制剂，主要通过选择性抑制DDP-4的活性，从而延长GLP-1的作用。GLP-1增加β细胞数量的作用被视为其重要的β细胞保护效应，有研究显示，GLP-1的这一作用是依赖于PDX-1基因的正常表达。PDX-1是β细胞内重要的转录因子，参与β细胞胰岛素基因的转录调控，从而实现β细胞再生和修复。本实验通过建立T2DM大鼠模型，观察西格列汀对T2DM大鼠胰腺PDX-1基因表达水平的影响，探讨其对胰岛β细胞增殖与再生的作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周近交系雄性SD大鼠60只(SPF级)，体质量(200±20)g，购自广东医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2008-0008。

1.2 主要试剂及仪器

链脲佐菌素购自美国Sigma公司，real-time PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司，反转录试剂盒购自美国Promega公司，西格列汀购自默沙东公司，血糖仪及血糖检测试纸条购自德国罗氏公司,PCR仪购于德国Biometra公司。

1.3 动物模型的建立

雄性SD大鼠适应性喂养1周，随机分为：正常对照组、糖尿病模型组、西格列汀组，每组20只。正常对照组给予普通饲料喂养，其余两组给予高脂饲料喂养8周。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg，正常对照组注射同等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。实验组72 h后测随机尾静脉血糖。以两次随机血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，然后西格列汀组给予西格列汀100 mg/kg灌胃，每日1次；正常对照组和模型组则给予相同体积生理盐水灌胃。

1.4 糖脂代谢指标测定

用全自动生化分析仪检测血清空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)，ELISA法检测血清胰岛素(INS)。ISI=Ln[1/FBG·FINS]。

1.5 胰岛细胞组织学观察

将固定于10%甲醛中的胰岛脱水后常规石蜡包埋，切片。将切片二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，伊红染色，苏木精复染，梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片。光镜下观察，进行病理学分析。

1.6 Real-Time RT-PCR法检测胰腺组织PDX-1 mRNA

Trizol一步法提取总RNA。取2 μg mRNA逆转录为cDNA，进行PCR扩增(反应条件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40个循环，62 ℃ 30 s收集荧光信号)；融解曲线分析：温度60-95 ℃。PDX-1 mRNA的引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，上游引物：5′-GCGAGATGCTGGCAGACC TCT-3′，下游引物：5′-GGCAGACCTGGCGGTTCACAT-3′,片段长度94 bp;以18sRNA为内参，上游引物：5′-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3′，下游引物：5′-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3′，片段长度108 bp;PCR反应条件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40个循环，62 ℃ 30 s收集荧光信号；融解曲线分析：温度60-95 ℃。DNA扩增仪自动分析并计算结果。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行数据处理。定量资料组内数据比较采用配对t检验，组间数据比较采用onewayANOVA分析及q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖、血脂及相关指标情况

与正常对照组比较，糖尿病模型组及西格列汀组FBG、FINS、TG、TC明显升高(P<0.01)，ISI明显降低(P<0.01)。西格列汀组治疗后与治疗前及糖尿病模型组比较，FBG、FINS、TG、TC明显降低(P<0.01)，ISI明显升高(P<0.01)；而模型组FBG、FINS、TG、TC较治疗前明显升高(P<0.01)，ISI明显降低(P<0.01，见表1，2)。

组别nFBG(mmol/l)FINS(mU/L)ISI治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后正常对照组205．13±0．645．32±0．79 15．14±1．3515．40±1．22 -4．34±0．21-4．39±0．23 模型组2014．17±0．72∗16．81±2．05∗△30．06±1．50∗30．59±1．64∗-6．04±0．09∗-6．21±0．16∗西格列汀组2014．40±0．94∗8．99±1．61∗#△30．14±1．48∗27．55±1．25∗#△-6．07±0．09∗-5．60±0．22∗#△ F197．24861．316310．906285．950477．007175．017 P0．0000．0000．0000．0000．0000．000

与正常对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与治疗前比较,△P<0.05

组别nTGTC治疗前治疗后治疗前治疗后正常对照组200．79±0．080．82±0．101．45±0．251．53±0．20模型组201．73±0．11∗2．02±0．22∗1．97±0．24∗2．41±0．29∗西格列汀组201．76±0．12∗1．24±0．22∗#△202±035∗166±037∗#△ F23045787447999013967 P0000000000010000

与正常对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与治疗前比较,△P<0.05

2.2 西格列汀对大鼠胰腺组织的影响

正常对照组大鼠胰腺组织HE染色，胰岛呈圆形或卵圆形，分布均匀、形状规则、界限清楚，胰岛细胞数量多。模型组胰岛体积变小，分布弥散，部分胰岛排列、形状不规则，结构不清，胰岛细胞数量减少，部分可见细胞核固缩。西格列汀组胰岛形状偶可见不规则，界限稍模糊，胰岛细胞数量较模型组增多(见图1)。

A.正常对照组 B.模型组 C.西格列汀组图1 各组大鼠胰腺组织HE染色 (×200)Figure 1 HE dying of pancreatic tissues in three groups (×200)

2.3 大鼠胰腺组织PDX-1 mRNA的表达

与正常对照组比较，模型组和西格列汀组PDX-1 mRNA的表达量均降低(P<0.01)，西格列汀组治疗后PDX-1 mRNA的表达量明显增高,与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

组别nPDX⁃1mRNA正常对照组204．23±0．24模型组201．00±0．05∗西格列汀组202．88±0．13∗#

经one-way ANOVA分析,F=1 069.57,P=0.000;与正常对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3 讨论

人类PDX-1在出生及成年后呈特异性表达于90%的β细胞和少量的(10%)δ细胞。近年来，由于PDX-1基因在胰岛素分泌过程中不可缺少，PDX-1在胰腺发育、分化、再生及胰岛素分泌过程中的作用受到关注[1-3]。因此，越来越多的研究致力于利用PDX-1在β细胞分化发育中的关键作用，将胚胎干细胞、成体肝细胞或胰腺导管上皮细胞等非胰岛素分泌细胞诱导分化成为具有分泌胰岛素功能的细胞[4]。Lee等[5]用编码小鼠PDX-1基因的重组腺病毒转染人类脂肪组织源性干细胞(human adipose tissue-derived stem cells,hASCs)，并将hASCs在高糖环境下分化，结果发现，过表达外源性的PDX-1能明显增加胰岛素基因的转录以及胰腺发育所必需的关键的转录因子如FoxA2、NKx2.2和NeuroD的表达。但长期高血糖、脂代谢紊乱可以损伤PDX-1基因,使PDX-l表达下调,使胰岛素的分泌减少，导致β细胞功能逐渐衰退,进而加重了糖脂代谢紊乱。在本实验中观察到,T2DM模型组大鼠FBG、TG、TC较正常对照组明显增高，PDX-1 mRNA表达下降，胰岛β细胞数量减少，表明糖脂毒性对T2DM大鼠胰岛β细胞具有损伤作用，导致胰岛细胞数量减少，而T2DM大鼠胰腺PDX-1表达的减少，可能正是T2DM大鼠胰岛β细胞功能减弱的重要原因。

已有研究表明，DPP-4抑制剂西格列汀可以通过提高GLP-1水平，降低胰高血糖素，降低肝脏及肠道内载TG脂蛋白的水平来影响TG水平以及改善血糖[6，7]。本实验结果亦显示，西格列汀组使用西格列汀干预后其血糖明显下降，其大鼠胰岛细胞数量较模型组增多，且胰腺胰岛β细胞PDX-1 mRNA的表达增多。上述结果表明西格列汀对胰岛胰岛β细胞的保护作用可能与其上调PDX-1有关，但具体机制尚不明确，有研究显示，GLP-1类似物Exendin-4诱导的胰岛素分泌细胞和胰岛细胞在形态学上类似，在脂肪间充质干细胞的培养液中加入Exendin-4，PDX-1及胰岛素基因的表达明显增多，胰岛素阳性细胞的比例增加了4倍，胰岛素分泌量亦增加了2.5倍。说明Exendin-4可通过增加PDX-1基因的表达来促进脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞转化[8]。Pugazhenthi等[9]发现DDP-4抑制剂阿格列汀可明显增加2型糖尿病大鼠胰岛β细胞胰岛素和PDX-1水平，且β细胞存活率亦明显增加。上述研究均证明了西格列汀可直接或间接调控PDX-1基因的表达，从而增加INS基因的转录，降低血糖。研究还发现，DPP-4抑制剂可增加β细胞分化和增殖，增强胰岛体系结构重塑并保持胰岛功能[10]。本研究表明，西格列汀对糖脂代谢紊乱起着正向作用，并可增加胰岛β细胞PDX-1 mRNA的表达，并一定程度地改善胰岛β细胞功能。

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Effect of sitagliptin on the expression of PDX-1 mRNA in islet beta cells of type 2 diabetes rats

ZHENG Kunjie1,WU Ge2*,GENG Jianlin1,WU Meifen2,FANG Shuo2

(1DepartmentofEndocrinology,HarrisonInternationalPeaceHospitalofHengshuiCity,Hengshui053000，China；2DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:wuge427427@126.com)

ObjectiveTo explore the influence of sitagliptin on the glucose and lipid metabolism and the expression level of pancreatic duodenal homeobox-1(PDX-1)mRNA in type 2 diabetes rats.MethodsSixty SD rats were randomly divided into normal control group,T2DM group and sitagliptin group.The rats were given normal diet in normal control group.The rats were given high fat diet in T2DM group and sitagliptin group,and the rats were intraperitoneally injected with streptozotocin(STZ)30 mg/kg at the end of 8 weeks. The rats in sitagliptin group were treated with daily intragastric sitagliptin(100 mg/kg)for 4 weeks after the modeling.Hematoxylin and Eosin staining was used to observe the histological changes of islet cells.Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(real-time RT-PCR)was used to detect the expression of PDX-1 mRNA in pancreatic islet cells.ResultsBefore treatment,the levels of FBG,FINS,TG and TC in sitagliptin group and T2DM group were significantly higher than in normal control group(P<0.01),while the level of ISI and the expression of PDX-1 mRNA were significantly lower.After treatment,the levels of FBG,FINS,TG,TC in sitagliptin group were decreased(P<0.01)，while the level of ISI was significantly increased(P<0.01).The expression of PDX-1 mRNA in sitagliptin group was significantly higher than in T2DM group(P<0.01).ConclusionSitagliptin can upregulate the expression of PDX-1 mRNA.

sitagliptin； diabetes mellitus； islet beta cells； PDX-1； rats

广东省科技计划资助项目(2011B031800231)

郑坤杰，女，1986-02生，硕士，住院医师，E-mail:w820lxy@sohu.com

2016-10-26

R587.1

A

1007-6611(2017)03-0231-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.007