金线莲总黄酮的最佳超声提取工艺

王澄林，张勋，陈抒云，黄泽豪，朱志灵，林羽（.福建中医药大学药学院，福建福州350；.福建中医药大学，福建福州350）

金线莲总黄酮的最佳超声提取工艺

王澄林1，张勋1，陈抒云1，黄泽豪1，朱志灵1，林羽2
（1.福建中医药大学药学院，福建福州350122；2.福建中医药大学，福建福州350122）

目的优化金线莲总黄酮的超声提取工艺。方法用紫外-可见分光光度比色法测定黄酮含量，用L9（34）正交试验，考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数对金线莲总黄酮含量测定的影响。结果最优的提取工艺为40倍量的95%乙醇超声提取3次，每次40 min，金线莲的总黄酮提取率为2.06%。结论乙醇浓度对总黄酮的提取率有显著影响，经优化的提取工艺，操作简单，提取效率较高，方法稳定、可行。

金线莲；总黄酮；超声提取；最佳工艺；正交设计

我们用正交试验法，以金线莲总黄酮含量为指标，超声提取为方法，考察不同因素对金线莲总黄酮含量测定的影响，以确定其最佳提取工艺。

1 材料与仪器

1.1 药材金线莲样品由福建虎伯寮生物集团有限公司提供，3个月全株苗，经福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定为兰科开唇兰属的福建金线莲Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.。

1.2 试剂芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：10080—200707）；亚硝酸钠（上海联试化工试剂有限公司）；硝酸铝（上海展云化工有限公司，批号：0909179）；氢氧化钠、甲醇、乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080605、20150209、20150126）；超纯水（实验室自制），试剂均为分析级。

1.3 仪器CP214型分析天平（美国奥豪斯仪器上海有限公司）；KQ—500DE超声提取仪（昆山市超声仪器有限公司）；DLSB—5／20低温冷却循环泵、SHB—III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE—2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TDL80—2B离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV—9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。

2 方法

2.1 标准溶液的配制称取芦丁对照品5 mg置于25 mL瓶中，加15 mL甲醇超声溶解后定容至刻度，即得标准溶液。

2.2 供试品溶液的制备称取干燥、粉碎过60目筛的金线莲粉末0.5 g置于25 mL具塞三角烧瓶中，按L9（34）正交设计，加入20 mL 95%乙醇浸泡过夜，超声提取功率为300 W。3 000 r／min离心15 min，过滤，提取3次，每次40 min，合并滤液，45℃真空减压浓缩至干，加适量甲醇使溶解并转移至100 mL瓶中，既得。

2.3 金线莲总黄酮含量测定吸取供试品溶液5 mL置25 mL瓶中，加1 mL 5%亚硝酸钠，摇匀，放置6 min，再加1 mL 10%硝酸铝，摇匀，放置6 min，最后加10 mL 4%NaOH溶液，混匀，甲醇定容，放置15 min。以不加芦丁对照品的试剂为空白对照，在最大吸收波长501 nm处测定吸光度值，计算总黄酮的提取率。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察取芦丁标准品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分别置于25 mL瓶中，配制不同浓度标准品溶液，按2.3项方法测定吸光度值。

2.4.2 精密度考察40倍量的95%乙醇超声提取3次，每次40 min，提取金线莲总黄酮，得样品溶液。在相同条件下平行测定5次吸光度值，计算RSD。

2.4.3 稳定性考察将2.4.2项的样品溶液每隔10 min测定1次吸光度值，连测5次，计算RSD。

2.4.4 加样回收率试验取5个25 mL瓶，分别加入5 mL已知含量的样品溶液和2.5 mL浓度为0.2 mg／mL的芦丁标准品溶液，按照2.3项方法测定吸光度值，平行测3次，计算总黄酮含量，得平均回收率和RSD。

2.5 正交实验设计试验考察了提取方法（回流提取和超声提取）、提取溶剂（甲醇和乙醇）、浸泡时间（6、12、18、24 h）以及溶剂浓度、料液比、提取时间、提取次数，确定了这4个主要因素，同时对4个主要因素进行水平筛选，确定了3个水平，因素与水平设计见表1。

3 结果与分析

3.1 最大吸收峰见图1。光谱扫描结果表明在501 nm处有最大吸收峰。

3.2 标准曲线及回归方程以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：

表1 正交试验因素水平表

图1 光谱扫描曲线

结果表明芦丁浓度在0.008～0.048 mg／mL，吸光度值与浓度呈良好的线性关系。

3.3 精密度考察5次测定的吸光度值为0.251、0.251、0.252、0.251、0.253，计算得吸光度的RSD为0.35%，表明精密度良好。

3.4 稳定性考察每隔10 min测定的吸光度值为0.252、0.252、0.250、0.249、0.249，计算得吸光度的RSD为0.52%，表明样品溶液在1 h内具有良好的稳定性。

3.5 加样回收率见表2。

表2 加样回收率试验（n＝3）

结果表明平均加样回收率为101.04%，RSD为4.5%。

3.6 正交试验结果见表3、表4。

表3结果表明，A项极差最大，C项极差最小，即4个因素对金线莲总黄酮提取率的影响程度为：A＞D＞B＞C。结果表明，乙醇浓度对金线莲总黄酮提取率影响最大，提取次数次之，提取时间影响最小。

表3 L9（34）正交试验结果

表4 方差分析

表4结果表明，乙醇浓度对金线莲总黄酮提取率有显著影响，其它3个因素无显著性影响。综合极差和方差分析的结果，提取金线莲总黄酮的最佳工艺条件为A1B3C1D3，即40倍量的95%乙醇超声提取3次，每次40 min。

3.7 验证试验为验证该工艺的稳定性和合理性，以最佳提取工艺条件进行验证试验，结果见表5。

表5 验证试验结果

表5结果表明，金线莲总黄酮提取率平均值为2.06%，RSD为1.45%，此结果表明该提取工艺条件稳定可行。

4 讨论

本实验通过L9（34）正交试验，最终确定金线莲总黄酮的最佳提取工艺为40倍量的95%乙醇超声提取3次，每次40 min，提取功率300 W。研究结果表明，用超声提取法在保证提取效率的前提下，简化了文献报道的溶剂回流提取法对金线莲总黄酮类的提取工艺，操作方法简便，提取效率较高，建立的超声提取金线莲黄酮类成分的最佳工艺条件，有助于金线莲检测质量的控制。

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R284.2

B

1000-338X（2017）01-0040-03

2016-09-08

福建省炮制传承基地建设重点学科专项（X2014131-学科）。

王澄林（1991—），女，2014级中药学专业硕士研究生，主要从事药物分析与质量评价研究。

林羽（1966—），男，主任药师。E-mail：yulam@163.com