寒湿型兔颈型颈椎病模型的建立与评估

张圆芳，何坚，柳维林，董继泉（福建中医药大学康复医学院，福建福州350122）

寒湿型兔颈型颈椎病模型的建立与评估

张圆芳，何坚，柳维林，董继泉
（福建中医药大学康复医学院，福建福州350122）

目的建立兔的颈型颈椎病模型。方法以低头位加寒湿刺激法建立兔颈型颈椎病模型，用HE染色法观察颈肌、椎间盘形态学变化，用Elisa法观察兔血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平。结果与正常组比较，模型组颈肌细胞肿胀变形，肌纤维断裂，出现炎症细胞；椎间盘髓核细胞破裂，纤维环区出现大量炎症细胞和多处坏死;血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著升高（P＜0.01）。与造模前比较，模型组造模后血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著升高（P＜0.01）。结论低头位加寒湿刺激法可成功建立兔颈型颈椎病动物模型，其血清炎症水平显著性升高。该模型及其评估方法，操作简单，无创、适用性强。

颈型颈椎病；大白兔病理模型；评估

在实验动物上模拟颈型颈椎病，是目前研究颈型颈椎病的重要途径之一［1］。查阅文献可发现采用低头架固定建立颈型颈椎病动物模型［2-3］的方法操作简单，且对所需观察组织无直接干扰。但对此模型的验证至今尚未形成统一标准［4］。我们参照张欣等［5］无创兔颈型颈椎病动物模型的建立方法进行改良，建立兔颈型颈椎病模型，通过检测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平来评估该模型是否成功［6］，以期为颈型颈椎病动物模型的建立提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组6月龄健康清洁级新西兰大白兔24只（动物批号：2007001104542），雌雄各半，体质量（2.5±0.5）kg，由上海市松江区松联实验动物场提供，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0011。根据随机数字表分为正常组和模型组，每组12只。

1.2 实验药物、试剂及器材兔子固定器（苏州市苏杭科技器材有限公司）；剃毛器（福州沃森生物技术有限公司）；冰袋（自制）；Elisa试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；一次性使用静脉血样采集针（山东成武赛诺医疗器械有限公司）；一次性使用真空采血促凝剂管（江苏康健医疗用品有限公司）；4%多聚甲醛（索莱宝生物科技有限公司）；EDTΑ-2Nα（天津市福晨化学试剂厂）；无水乙醇（西陇化工股份有限公司）；苏木素、伊红染液（索莱宝生物科技有限公司）；粘附载玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；包埋机（孝感市亚光医用电子技术有限公司）；莱卡切片机、电子显微镜（德国莱卡仪器有限公司）；烤片机（上海市跃进医疗器械厂）。

1.3 模型制备参照张欣等［3］无创兔颈型颈椎病动物模型的建立方法进行改良造模。2组动物在动物房适应环境1周后，采集血液，用Elisa试剂盒检测兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平，作为造模后这些炎症因子的检测基线，然后进行造模。模型组12只兔子用剃毛器剔去颈部毛发，置于改造后的兔子固定器中，使兔的颈部成低头屈曲位45°，后颈部肌肉呈牵拉状态，同时敷以自制保湿冰袋，调节冰袋松紧并将其固定于兔子固定器两侧。每次造模5 h，每日1次，共56 d。模型组兔每天固定结束后常规饲养于兔笼中，正常饮食饮水，自由活动。正常组兔子常规饲养于笼中，正常饮食饮水。注意每天观察每只动物精神状态、饮食、运动、大小便等一般情况，每周称体质量1次。

1.4 标本取材造模结束后次日正常组和模型组兔的耳缘静脉采血，观察模型组兔颈后肌肉硬度变化情况。每只兔采血5 mL置于离心管，4℃环境下及时以3 500 r／s离心20 min，吸取上清液，注入无菌Eppendorf管内，-80℃冰箱内保存待测。

取血后耳缘静脉空气栓塞处死，迅速在兔经筋颈部的起止点周围部位剪取组织，在C3-6棘突旁2 cm处取皮下肌肉组织1 cm×1 cm×1 cm，置4%多聚甲醛中48 h，修剪组织水平面和横断面，长1 cm，宽0.5 cm，厚0.3～0.4 mm，放入70%酒精过夜，第2天进行脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋。

取下颈肌后，继续分离剩下的肌肉组织，用咬骨钳取下整段颈椎，尖刀钝性分离出C4－5椎间盘组织，置4%多聚甲醛中48 h，然后换10%脱钙液进行脱钙2～3个月。以注射器针头扎进时，无明显阻力为宜。包埋前修剪出组织横切面，大小同上颈肌组织，然后放入70%乙醇过夜，第2天80%乙醇2 h，90%乙醇2 h，95%乙醇2 h，100%乙醇30 min，100%乙醇30 min，100%乙醇2 h，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ15-20 min，蜡Ⅰ15 min，蜡Ⅱ15 min，蜡Ⅲ60 min，石蜡包埋。

1.5 光镜下颈肌和椎间盘组织形态学观察正中冠状位切片，厚度5～6 μm，捞片后自然晾干，60℃烤箱2～3 h，放入4℃冰箱保存，HE染色。染色前将切片置于37℃烘箱30 min，进行脱水和染色：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ15 min，100%乙醇5 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，自来水浸泡30 s／次，共2次，自来水浸泡5 min，苏木素5 min，自来水浸泡30 s，盐酸分色3 s，自来水浸泡30 s，返蓝30 min，伊红1 s，自来水浸泡30 s，吹风机吹干，封片，晾干后拍片即光学显微镜观察的肌肉和椎间盘组织形态学变化。

1.6 Elisa检测兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平按说明书进行操作。标品和样品做复孔，IL-1β和IL-6的标准曲线均是从1 000 pg／mL开始，减半递减，共8个主孔及相应复孔，TNF-α的标准曲线是2 000 pg／mL开始，减半递减，共8个主孔及相应复孔。加样前先配好指标各梯度的标准样品液，具体步骤：标准品及样品主、复孔各加入相应液体100 μL／孔，震荡均匀后封闭，37℃烘箱孵育40 min。洗板4～6次，每次震荡30～60 s，最后1次洗板后拍板至孔底部无水迹为宜。每孔加蒸馏水和第一抗体工作液（除空白孔外）50 μL，震荡均匀后封闭，37℃烘箱孵育20 min，洗板，同前。每孔加酶标抗体工作液100 μL，震荡均匀后封闭，37℃烘箱孵育10 min，洗板，同前。每孔避光加底物工作液100 μL，震荡均匀后封闭，37℃烘箱孵育15 min。每孔加终止液100 μL，震荡均匀后，30 min内酶标仪检测OD值。

2 结果

2.1 颈肌组织形态学HE染色观察正常组颈肌纵切面肌细胞呈长条状整齐排列，细胞核椭圆形，肌原纤维沿细胞长轴排列，明暗带清晰；模型组颈肌纵切面肌细胞肿胀变形，肌原纤维排列不整齐，明暗带消失，肌纤维断裂处存在炎症细胞，主要为巨噬细胞。正常组颈肌横切面肌组织排列整齐；模型组颈肌横切面纤维断裂，出现炎症细胞，主要为巨噬细胞。

2.2 颈椎间盘组织形态学HE染色观察正常组颈椎间盘髓核细胞完整，排列规整，髓核外周包绕的是纤维环，其细胞为长梭状，胶原纤维呈致密板层状排列有序，髓核和纤维环之间界限清晰；模型组颈椎间盘髓核出现皱缩，细胞破裂甚至坏死，纤维环排列较正常组杂乱，出现大量炎症细胞和坏死。

2.3 血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平比较见表1、表2。

表1 2组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平比较

表1 2组IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平比较

注：与正常组比较，1）P＜0.01。

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表2 模型组造模前后IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平比较pg／mL

表2 模型组造模前后IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平比较pg／mL

注：与造模前比较，1）P＜0.01。

组别造模后造模前n 12 12 IL-1β 15.074±1.0791）5.725±0.762 IL-6 9.416±1.0491）3.968±0.354 TNF-α 16.678±3.0211）5.968±0.267

3 讨论

实验通过检测兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平来评估低头位加寒湿刺激法制作的兔颈型颈椎病模型是否成功，结果显示模型组兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平高于正常组；模型组造模后的血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平高于造模前。结果说明通过检测兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平来评价兔颈型颈椎病模型建立成功与否的评估方法，操作简单，无创，适用性强，有利于后续干预实验的进行。

［1］陈志达，林斌，李炳文，等.颈椎病动物模型的研究进展［J］.风湿病与关节炎，2014，3（8）：57-61.

［2］林强，苑洁，钟力炜，等.颈型颈椎病家兔模型的Ca2+-ATP酶及SOD、MDA含量变化［J］.按摩与康复医学，2014，5（11）：202-203.

［3］张义，刘福水，钟鼎文，等.长期异常应力对家兔颈后肌肌外膜胶原纤维超微结构的影响［J］.现代中西医结合杂志，2013，22（8）：818-820.

［4］肖显俊，冯跃，陈香竹，等.自制低头架制作家兔颈椎病模型［J］.按摩与康复医学，2015，6（2）：122-124.

［5］张欣，李殿宁，李开平，等.无创兔颈型颈椎病动物模型的建立［J］.中华中医药学刊，2015，33（4）：913-916.

［6］张红利，沈霖.颈椎病兔模型TNF-а、SP、NPY、CGRP的变化及意义［J］.数理医药学杂志，2012，25（4）：410-412.

R-332

A

1000-338X（2017）01-0026-02

2016－10－18

国家自然科学基金资助课题（8157150620）

张圆芳（1988—），女，2014级中医康复学专业硕士研究生，主要从事骨关节病康复的基础研究。

何坚（1970—），男，副教授。E-mail：591003659@qq.com