半枝莲阻滞人结肠癌细胞周期的机制

张铃，方翌，蔡巧燕，林珊，魏丽慧，彭军（福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

半枝莲阻滞人结肠癌细胞周期的机制

张铃，方翌，蔡巧燕，林珊，魏丽慧，彭军
（福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

目的研究半枝莲氯仿极性部位提取物（ECSB）阻滞人结肠癌细胞周期的机制。方法用ECSB干预结肠癌细胞株HCT-8、SW620，检测其细胞周期相关基因的表达。结果ECSB干预SW620细胞后，其p16表达上升，PCNA表达下降；ECSB干预HCT-8细胞后，Cyclin D1、CDK2、CDK4表达下降。结论ECSB通过调控细胞周期相关基因的表达，抑制人结肠癌细胞的增殖。

半枝莲氯仿极性部位提取物；结肠癌；细胞周期

结肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前治疗CRC的常见方法有手术、放疗、化疗、靶向治疗等，但均未取得突破性进展，主要原因是肿瘤细胞具有无限增殖能力，容易产生复发和转移。半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，归肺、肝、肾、大肠经，具有清热解毒、活血化瘀、利尿消肿的功效［1］。临床证实半枝莲与其它药物联合应用，可明显减轻患者放化疗的副作用，改善生活质量，延长生存时间。半枝莲对肿瘤的疗效确切，但由于组分复杂使得其抗肿瘤的有效成分仍然未知。我们前期研究将半枝莲萃取为氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚，初步确定氯仿极性部位提取物（ECSB）为4个部位中最有效的抗肿瘤部位［2］。本研究从ECSB阻滞人结肠癌细胞周期方面进行研究，以确定半枝莲的物质基础及作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞来源结肠癌细胞株SW620（上海中科院细胞库）；HCT-8（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.2 药物与试剂半枝莲购于福建中医药大学国医堂；L-15、RPMI-1640培养基（南京凯基生物科技发展有限公司）；胰蛋白酶、胎牛血清、Trizol、Super-Script III First-Strand Synthesis System试剂盒（美国Invitrogen公司）；Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix试剂盒（美国Fermentas公司）；氯仿、异丙醇、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；引物合成、DEPC处理水（上海生物工程有限公司）；Taq酶（德国Sigma公司）；GenomeLabTM Gexp start kit试剂盒、分离胶、甲酰胺（SLS）、DSS-400（美国Beckman公司）。

1.3 主要仪器CO2培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司），PCR扩增仪（美国Bio-rad公司），GenomeLabTM Gexp遗传分析系统（美国Beckman公司）。

2 实验方法

2.1 半枝莲不同极性部位提取物的制备制备方法见文献［2］。

2.2 细胞培养将结肠癌细胞株SW620和HCT-8分别接种到250 mL的培养瓶中，加入含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 μg／mL链霉素的L-15和RPMI-1640培养基，在37℃、5%CO2培养箱进行传代培养。

2.3 RT-PCR检测SW620细胞基因表达SW620以5×105个／mL接种于6孔板中，加入25、50、75 μg／mL ECSB干预24 h后收集细胞。用Trizol提取总RNA，-20℃保存备用。用SuperScript III First-Strand Synthesis System试剂盒进行逆转录，将获得的cDNA通过PCR扩增得到p16（多肿瘤抑制因子）、PCNA（增殖细胞核抗原）基因，以GAPDH为内参。PCR扩增用Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix试剂盒，具体操作按试剂盒说明书。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压80～100 V。电泳结束后，用凝胶成像系统进行图像采集。

2.4 Gexp技术检测HCT-8细胞基因表达HCT-8以2×105个／mL接种于6孔板中，加入150 μg／mL ECSB干预48 h后收集细胞，用Trizol提取总RNA，-20℃保存备用。引物配制：将要检测的所有基因的下游引物混合，配制终浓度为500 nmol／L的混合液。将要检测的所有基因的上游引物混合，配制终浓度为200 nmol／L的混合液。逆转录时用下游混合引物，PCR时用上游混合引物，其余加样按试剂盒说明书操作。逆转录的反应程序为：48℃1 min，42℃1 h，95℃5 min，4℃hold。将获得的cDNA进一步通过PCR扩增得到Cyclin D1（细胞周期素D1）、CDK2（细胞周期素依赖性激酶2）、CDK4（细胞周期素依赖性激酶4）基因。PCR的反应程序为：94℃1 min（94℃30 s，55℃30 s，70℃1 min）×35个循环。用SLS稀释Marker（DSS-400），PCR产物经稀释后进行毛细管电泳分离，用默认分析参数对毛细管电泳的结果进行片段分析。以TBP、GAPDH、CYPLOPHOH为参考基因，将其峰值求几何均数，各基因的峰值与该几何均数的峰值相除，得到各基因的相对表达量。

3 实验结果

实验结果见图1、表1。

图1 RT-PCR检测SW620细胞在ECSB干预后其p16、PCNA的mRNA表达量

表1 Gexp检测HCT-8细胞在ECSB干预后其Cyclin D1、CDK4、CDK2的mRNA表达量

表1 Gexp检测HCT-8细胞在ECSB干预后其Cyclin D1、CDK4、CDK2的mRNA表达量

注：与0 μg／mL组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

ECSB浓度150 μg／mL组0 μg／mL组CDK2 0.41±0.111）0.70±0.28 n 3 3 Cyclin D1 1.73±0.602）17.45±4.58 CDK4 1.78±0.222）6.04±0.50

4 讨论

4.1 细胞周期中可以影响细胞从一个时期向另一个时期转换的时间点，称为限制点。常见的限制点有G1／S、G2／M和纺锤体装配限制点。恶性肿瘤的生物学特性之一就是使这些限制点紊乱，导致细胞的失控性增殖［3］。红花多糖能阻滞肝癌SMMC-7721细胞在G2／M期［4］，白花蛇舌草能阻滞结肠癌HT-29细胞在G1／S期［5］。细胞周期的调控可分为外源性和内源性途径进行，内源性途径主要是通过细胞周期素（Cyclins）、细胞周期素依赖性激酶（CDKs）、细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CKIs）的调控来实现［6］。CDKs与不同的Cyclins结合形成二聚体后驱动细胞进入不同的时期，其中CDK2、CDK4能结合Cyclin D1，控制细胞G1／S期的进展。研究［7］表明许多肿瘤的CDKs和Cyclins常过度表达，从而导致其细胞周期的异常活跃。CKIs参与细胞周期限制点的负调控，阻滞细胞周期进展，这些小分子蛋白家族为细胞周期抑制蛋白，包括p16、p53、p27、pRB［8］，其中p16基因位于人类的第9号染色体短臂2区1带（9p21），能抑制CDK4的活性，阻止细胞进入S期，在许多恶性肿瘤中存在纯合性缺失［9－10］。

4.2 我们前期研究通过colony formation实验证实，ECSB能显著抑制SW620细胞的增殖，并且是通过下降Cyclin D1和CDK4的表达所介导的，但对p16的影响不明确。本实验在前期研究基础上进一步证实SW620细胞在ECSB干预24 h后，其p16的表达呈剂量依赖性的上调。本实验在另外一株结肠癌细胞HCT-8中也得到相同结果。150 μg／mL ECSB能下调HCT-8细胞的Cyclin D1、CDK4、CDK2，提示ECSB可通过调控细胞周期的相关基因起到抑制细胞增殖的作用。

4.3 ECSB能显著下调SW620细胞的PCNA表达，并呈剂量依赖性，证明了ECSB能抑制结肠癌细胞的增殖。

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R285.5

A

1000-338X（2017）01-0024-02

2016-10-05

福建省自然科学基金资助课题（2015J01687）；福建省卫生厅青年科研项目资助课题（2014-2-29）；

张铃（1986—），女，理学硕士，实验师，主要从事中药抗肿瘤的机制研究。

彭军（1969—），男，教授。E－mail：pjunlab@hotmail.com