冠心病患者血清心肌肌钙蛋白I自身抗体检测的意义

张金花，张葵，魏红霞，邱方

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008；2.东南大学生命科学研究院，南京 210096)

·研究生园地·

冠心病患者血清心肌肌钙蛋白I自身抗体检测的意义

张金花1，张葵1，魏红霞1，邱方2

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008；2.东南大学生命科学研究院，南京 210096)

目的 观察冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)患者血清心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)自身抗体的阳性率和临床意义。方法 病例对照研究。收集2015年9月至2016年5月南京大学医学院附属鼓楼医院心内科CHD患者200例和健康体检者200例，用间接ELISA法检测抗cTnI自身抗体(anti- cardiac troponin I antibodies，anti-cTnI)，并分析其一般资料、相关临床生化指标和冠脉血管病变情况。结果 CHD患者anti-cTnI阳性率10.5%(21/200)，健康体检者阳性率为2.0%(4/200)，CHD患者高于健康体检者(P<0.01);根据抗体检测结果将研究对象分为冠心病患者抗体阳性组,冠心病患者抗体阴性组和健康对照者抗体阳性组。冠心病患者抗体阳性组中位年龄、Glu水平高于健康对照者抗体阳性组(P均<0.05)，HDL-C、apoAⅠ水平低于健康对照者抗体阳性组(P均<0.01);CHD患者抗体阳性组中位年龄与Gensini评分高于抗体阴性组，而HDL-C水平低于抗体阴性者(P均<0.05)。结论 Anti-cTnI更可能出现在年龄较高且冠脉狭窄病变较严重的冠心病患者中，血清低HDL-C和apoAⅠ水平可能与anti-cTnI产生有关。

冠心病；抗心肌肌钙蛋白自身抗体；自身免疫；Gensini评分

动脉粥样硬化实质上是一种多因素免疫介导的动脉壁的慢性炎症过程，自身免疫反应在动脉粥样硬化形成和发展中发挥重要作用[1-3]。抗cTnI自身抗体(anti- cardiac troponin I antibodies，anti-cTnI)已被报道在扩张型心肌病、心肌炎、缺血性心肌病、肥厚型心肌病、心肌梗死等患者及极少数健康人群中检出[4]。目前，国内对anti-cTnI的研究较少。本研究旨在观察冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)患者anti-cTnI检出情况，并探讨其与患者相关临床生化指标和冠状动脉血管病变情况的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2015年9月至2016年5月南京市鼓楼医院CHD确诊患者200例，其中男148例，女52例，年龄27～96岁，中位年龄57岁，CHD诊断依据中华医学会心血管病学分会《2007年冠心病诊断与治疗指南》。纳入标准：(1)根据冠状动脉造影结果，证实存在主要管腔狭窄的直径≥70%或至少有一支冠状动脉管腔狭窄直径≥50%；(2)有血管形成术的病史；(3)有冠状动脉搭桥术病史。具备以上任何一条即可纳入病例组。对患有自身免疫性疾病，肝肾疾病，血液系统疾病，恶性肿瘤及近期有手术、外伤和感染的患者予以排除。选择同期南京市鼓楼医院体检健康者200例为健康人对照组，其中男94例，女106例，年龄17～79岁，中位年龄42岁。本研究经南京大学医学院医学伦理学委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 标本采集与处理 CHD患者入院后6～24 h采集空腹静脉血3 mL，3 000 r/min离心5 min，2 h内完成临床生化指标检测。收集血清于2 mL EP管中，-80 ℃保存以待检测anti-cTnI，避免反复冻溶。

1.3 仪器和试剂 AU5421全自动生化分析仪(美国Beckman Coulter公司)；三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、葡萄糖(Glu)试剂购自日本第一化学药品株式会社试剂诊断公司；载脂蛋白AⅠ(apoAⅠ)、载脂蛋白B(apoB)检测试剂购自宁波美康公司；3%小牛血清清蛋白(BSA)(上海麦约尔公司)，明胶(加拿大Sigma-Aldrich公司)，重组人cTnI蛋白(东南大学生命科学研究院赠予)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG、IgM和IgA二抗(德国Merck公司)，四甲基联苯胺(TMB,上海科华公司)，蛋白质Marker(日本Takara公司)，十二烷基硫酸钠、苯烯酰胺、TEMED(美国Sigma公司)，Tris-HC1、过硫酸铵(上海生工公司)，电泳仪、Ecl化学发光试剂盒、凝胶成像系统(上海天能公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 生化指标检测 TG用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶(GPO-PAP)法测定，TC用酶法测定，HDL-C、LDL-C用化学修饰酶法测定，apoAⅠ、apoB用免疫透射比浊法测定；Glu用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法测定；anti-cTnI用间接ELISA法检测。

1.6 Western blot法验证anti-cTnI 配置12 g/L分离胶注入胶板内，凝固1 h，再配置5 g/L浓缩胶，将胶板固定于电泳槽，注入电泳缓冲液，将煮沸过的样品以每孔10 μL注入加样孔，80 V恒压30 min浓缩样品，待样品进入分离胶后改为120 V恒压1 h。将标准抗原cTnI经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后用Bio-Rad电转移系统将蛋白质转移至PVDF膜上。用0.05 g/mL BSA于37 ℃温育2 h，封闭后用PBST溶液洗涤3次，每次5 min。分别同时置于患者和健康对照者血清(1∶3 000稀释)中，4 ℃过夜，同样方法洗涤后，用HRP标记的羊抗人IgG、IgM和IgA二抗(1∶10 000稀释)37 ℃温育1 h，洗涤后在PVDF膜上滴加Ecl化学发光试剂显影并拍照记录。

1.7 Gensini法计算积分值 根据狭窄程度评估积分[5]：≤25%狭窄计1分；26%～50%狭窄计2分；51%～75%狭窄计4分；76%～90%狭窄计8分；91%～99%狭窄计16分；100%狭窄(全闭)计32分。根据病变部位不同，计算单处病变积分与系数乘积：左主干病变×5；左前降支或回旋支近段×2.5；左前降支中段×1.5；左前降支远段、左回旋支中段、左回旋支远段、右冠状动脉×1.0，小分支×0.5。各处积分求和，为每位患者的Gensini总积分。

2 结果

2.1 Anti-cTnI检测结果 SDS-PAGE电泳结果见图1，对ELISA检测高出cut-off值的血清用western blot方法确认后证实均为anti-cTnI抗体阳性。

2.2 Anti-cTnI阳性组生化指标结果 见表1。CHD患者中anti-cTnI阳性率10.5%(21/200)，健康体检者中阳性率2.0%(4/200)，差异有统计学意义(P<0.01)。按抗体检测结果将研究对象分为冠心病患者抗体阳性组、冠心病患者抗体阴性组和健康对照者抗体阳性组。冠心病患者抗体阳性组中位年龄和Glu水平高于健康对照者抗体阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)，而HDL-C、apoAⅠ水平低于健康对照者抗体阳性组(P<0.05)。

2.3 冠心病患者抗体阳性组与阴性组血管病变情况(血管病变支数、Gensini评分) CHD患者中，抗体阳性组中位年龄与Gensini评分高于抗体阴性组，而HDL-C水平低于抗体阴性组(P<0.05)。冠心病患者抗体阳性组血管多支病变(三支或三支以上主要血管)百分率低于阴性组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注：M,蛋白Marker。

图1 SDS-PAGE结果

3 讨论

Anti-cTnI最早由Shmilovich等[6]于2007年报道，存在于约16%的扩张型心肌病患者和18%的局部缺血性心肌病患者血清中，但健康个体中未发现。本研究检测了200例健康体检者，发现了4例自身抗体阳性，阳性率与Carbone等[7]报道相同。与健康体检者相比，CHD患者阳性率(10.5%)升高。Fan等[8]对491例ST段抬高型心肌梗死患者研究发现，anti-cTnI阳性率为19.1%(94/491)，且左心室重塑范围与抗体阳性率相关，anti-cTnI阳性患者左心室扩张程度和心室收缩功能减退程度更明显。

本研究中，冠心病患者抗体阳性组中位年龄高于健康对照者抗体阳性组(P<0.01)。apoAⅠ是HDL-C的主要载脂蛋白，HDL-C参与胆固醇的逆转运，将外周组织多余的胆固醇转运至肝脏代谢，减少外周血管壁脂质蓄积，维持脂质代谢平衡，从而发挥抗动脉粥样硬化作用[9]。本研究发现，与健康对照者抗体阳性组相比，冠心病患者抗体阳性组HDL-C和apoAⅠ水平降低，Glu水平增高，提示anti-cTnI参与冠状动脉综合征病程。冠脉狭窄性病变导致心肌缺血损伤，使cTnI暴露于循环系统，引发自身免疫发生，产生抗心肌细胞自身成分的抗体。本研究进一步分析血清anti-cTnI与Gensini评分的相关关系发现，冠心病患者中抗体阳性组Gensini评分高于抗体阴性组(P<0.05)。Gensini评分是对冠状动脉病变程度评估的经典方法[5]，冠状动脉病变越严重，Gensini评分越高;表明冠心病患者血清anti-cTnI可能有助于冠状动脉病变严重程度的评估。心肌梗死恢复期血清肌钙蛋白水平仍然升高[10]，心肌损伤后释放的cTnI与cTnC结合成cTnI-cTnC复合物持续存在于循环系统内可能是anti-cTnI形成的一个重要原因，而抗体滴度是否与肌钙蛋白水平成正比还有待研究。

目前尚无检测anti-cTnI的金标准,一些研究用免疫分析技术检测anti-cTnI。Adamczyk等[11]用化学发光acridinium-9酰胺抗人抗体包被化学发光微孔板，检测与cTnI高亲和力结合的IgG抗体，另一些学者用ELISA法[12]，不同方法在检测anti-cTnI的敏感性和特异性方面具有很大差异。有研究表明，检测急性冠脉综合征患者血清anti-cTnI滴度，发现肌钙蛋白抗体能干扰cTnI的免疫测量[13]。Anti-cTnI是否会对心肌造成更进一步的损伤，其产生与持续存在的原因及机制尚不明确，其可能的临床和诊断意义也需要进一步的探索。

[1]Campbell KA, Lipinski MJ, Doran AC,etal. Lymphocytes and the adventitial immune response in atherosclerosis [J]. Circ Res, 2012, 110(6): 889-900.

[2]Sasaki N, Yamashita T, Kasahara K,etal. Regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells as critical immune modulators in atherogenesis [J]. Curr Pharm Des, 2015, 21(9): 1107-1117.

[3]冯晓琳，张楠，汪俊军.血清补体C1q及其抗体检测的临床意义研究进展[J].临床检验杂志，2016,34(4)：287-289.

[4]Tom J, Natkunam K, Ryan G,etal. Anti-troponin antibodies following myocardial infarction [J]. J Cardial, 2016, online: 1-8.

[5]Gensini GG. A more meaningful scoring system for determining the severity of coronary heart disease [J]. Am J Cardiol, 1983, 51(3) :606.

[6]Shmilovich H, Danon A, Binah O,etal. Autoantibodies to cardiac troponin I in patients with idiopathic dilated and ischemic cardiomyopathy [J]. Int J Cardiol, 2007, 117(2): 198-203.

[7]Carbone F, Nencioni A, Mach F,etal. Evidence on the pathogenic role of auto-antibodies in acute cardiovascular disease [J]. Thromb Haemost, 2013, 109(5): 854-868.

[8]Fan Y, Chen YW, Wan ZF,etal. The prognostic value of autoantibodies against β1-adrenoceptor and cardiac troponin-I for clinical outcomes in STEMI [J]. J Cardiovasc Med (Hagerstown), 2017,18(1): 34-41.

[9]Tsompanidi EM, Brinkmeier MS, Fotiadou EH,etal. HDL biogensis and functions:role of HDL quality and quantity in atherosclerosis [J]. Atherosclerosis, 2010, 208(1): 3-9.

[10]Hera M，Sakata Y, Nakatani D,etal. Subclinical elevation of high-sensitive troponin T levels at the convalescent stage is associated with increased 5-year mortality after ST-elevation myocardial infarction [J]. J Cardiol, 2016, 67(4): 314-320.

[11]Adamczyk M, Brashear RJ, Matttingly PG. Circulating cardiac troponin-I autoantibodies in human plasma and serum [J]. Annals of the New York Academy Sciences, 2009, 1173: 67-74.

[12]Kaya Z, Katus HA, Rose NR. Cardiac troponins and autoimmunity:their role in the pathogenesis of myocarditis and of heart failure [J]. Clin Immunol, 2010, 134(1): 80-88.

[13]Tanja S, Emilia E, Janne E,etal. Troponin specific autoantibody interference in different cardiac troponin I assay configurations[J] . Clin Chem, 2012, 58(6): 1040-1048.

(本文编辑：王海燕)

Clinical significance of the detection of serum cardiac troponin I autoantibodies in the patients with coronary atherosclerotic heart disease

ZHANGJin-hua1,ZHANGKui1,WEIHong-xia1,QIUFang2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,Jiangsu; 2.InstituteofLifeSciences,SoutheastUniversity,Nanjing210096,Jiangsu,China)

Objective To observe the positive rate of serum anti-cardiac troponin I autoantibodies (anti-cTnI) in the patients with coronary atherosclerotic heart disease(CHD) and its clinical significance. Methods A total of 200 CHD patients and 200 healthy controls from the Department of Cardiology, Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School during September 2015 and May 2016 were collected in the case-control study. Serum anti-cTnI was detected with an indirect ELISA method. Meanwhile, the general data, clinical biochemical parameters and coronary vascular lesion from the two groups were analyzed. Results The positive rate of anti-cTnI in CHD patients(21/200, 10.5%) was significantly higher than that in healthy controls(4/200, 2.0%,P<0.01). According to the detection results of serum anti-cTnI, the participants were divided into three groups, including anti-cTnI positive group with CHD, anti-cTnI negative group with CHD and anti-cTnI positive group in healthy controls. The median age and serum Glu level in the anti-cTnI positive group with CHD were significantly higher than those in the anti-cTnI positive group in healthy controls (P<0.05), while the levels of serum HDL-C and apoAⅠwere inverse (P<0.01). The median age and Gensini score in the anti-cTnI positive group with CHD were significantly higher than those in the anti-cTnI negative group with CHD, while the level of serum HDL-C was inverse (P<0.05). Conclusion Anti-cTnI may be more likely to occur in old CHD patients with severe coronary artery lesions, and the low levels of serum HDL-C and apoA I may correlate to the production of anti-cTnI.

coronary atherosclerotic heart disease; anti-cardiac troponin I autoantibody; autoimmunity; Gensini score

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.14

张金花，1991年生，女，硕士研究生，研究方向为脂代谢与心血管疾病。

张葵，主任医师，教授，硕士研究生导师，13505151066@163.com。

R446；R54

A

2016-11-24)