支气管肺胞灌洗液细胞学检测方法的改良

马兴生,贺晓英,张晓琦,刘光福，杨国儒

(潍坊呼吸病医院检验科，山东潍坊 261041)

·临床检验技术研究·

支气管肺胞灌洗液细胞学检测方法的改良

马兴生,贺晓英,张晓琦,刘光福，杨国儒

(潍坊呼吸病医院检验科，山东潍坊 261041)

目的 针对支气管肺胞灌洗液(BALF)下标本处理过程中细胞退化变形问题进行改良。方法 分别用常规方法与改良方法(BALF标本离心后的沉渣按2∶1比例加入血清或血浆)对标本涂片染色，在相同显微镜下观察细胞形态，计算正常形态中性粒细胞的百分率。结果 两种涂片方法检出的正常形态中性粒细胞百分率差异有统计学意义(P<0.01)。结论 改良方法可较好地在室温下保持BALF标本中的细胞形态，避免细胞退化。

肺泡灌洗液；细胞退化；血清；血浆

按照目前的支气管肺胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)操作规范[1-3]对标本涂片处理，在实际临床操作过程中常遇到细胞严重退化变形的问题。通过在临床工作中不断实践与摸索，找到一种在室温条件下能较好解决细胞退化变形问题的新方法，现介绍如下以供同行交流。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 DM2500型光学显微镜(德国LEICA公司)，SC-3610型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器公司)，HYC-310型医用冷藏箱(青岛海尔特种电器公司)，MS3BS25型漩涡振荡器(德国IKA公司)，病理级高级载玻片(南通海伦生物医学器材制造公司)，12×100塑料试管(淄博来绪医用器材公司)，300目尼龙滤网(昆山鑫泰筛网滤网公司)，瑞氏-姬姆萨染色液(珠海贝索生物技术公司)，AB型血清或血浆。

1.2 标本采集及制备 2016年6至10月潍坊呼吸病医院BALF标本20例。每位患者行支气管镜检查时留取≥5 mL BALF，装入无抗凝剂硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附)，1 h内送检。

1.3 评定标准 中性粒细胞形态变化更明显并随保存时间延长而正常形态比例明显下降[4-5]；同样，在常温条件下，在计数BALF标本细胞分类时，中性粒细胞退化变形最明显。因此，选择以中性粒细胞的形态完整性作为衡量涂片质量的标准，并计数正常形态中性粒细胞的百分率。正常形态中性粒细胞标准：细胞形态完整，胞浆与核清晰。退化形态中性粒细胞标准：细胞胞浆不完整，核肿胀，甚至裸核或可见胞浆，不能分辨细胞核的形态。

1.4 实验方法 对同一份BALF标本分别采用常规涂片和改良方法涂片。改良方法是在常规涂片基础上加入人血清或血浆。具体操作步骤如下，(1)采集BALF后，尽快送达实验室，用300目尼龙滤网过滤到塑料试管中；(2)试管迅速以2 000 r/min离心7 min；(3)离心后的标本弃去上清，取试管底部沉渣；(4)在漩涡振荡器上把试管底部沉渣混匀；(5)按标本与血清或血浆2∶1的比例加入AB型血清或血浆于管内，与沉渣充分混匀后涂片；(6)涂片在室温自然风干后，用瑞氏-姬姆萨染色液染色；(7)在油镜下观察标本，计数中性粒细胞正常形态，以百分率表示。

1.5 统计学分析 用SPSS 19.0统计软件进行。由于2组数据方差不齐，两组间比较用两独立样本的秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规方法和改良方法涂片镜检结果 见图1。常规方法涂片中性粒细胞退化明显，背景不清，混杂成分较多。图1B 按2∶1比例加入AB型血清涂片，中性粒细胞形态清晰，浆、核明显，较少有退化，背景清晰。图1D 按2∶1比例加入AB型血浆涂片，粒细胞形态清晰，浆、核明显，较少有退化，背景更清晰。

2.2 常规方法和改良方法正常形态中性粒细胞的百分率 改良方法组的中性粒细胞正常形态百分率明显高于常规方法组。常规方法组的中性粒细胞正常细胞百分率(34.8±16.4)%，改良方法组(87.45±5.57)%，经两独立样本的秩和检验比较，两组差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 其他影响因素对实验结果的影响 除采用AB型血清或血浆外，还采用了O型血清或血浆(含抗A、抗B抗体)实验，中性粒细胞同样可保持良好的完整性，涂片结果并不受血型影响。按3∶1比例分别加入各型血清或血浆进行相关实验，显微镜下观察中性粒细胞仍可保持良好形态，但按1∶1比例加入血清或血浆，涂片染色时发现膜极易脱落。

注：A、C为常规方法涂片；B、D为分别为加入血清、血浆改良处理后的涂片。

图1 常规方法和改良方法涂片瑞氏-姬姆萨染色结果(×1 000)

3 讨论

近几年针对BALF细胞学检测方法的改良较多[6-7]。但在临床检验工作中，面临的细胞退化问题却无应对之策。由于细胞形态结构的完整性受温度、pH值、抗体等多种因素影响。按目前操作规范推荐的常规涂片方法，不能保持细胞原有形态，从本质上分析是由于细胞离开机体后，内环境发生改变，细胞出现退化。若能保持细胞内环境的稳定，让离体细胞所处环境与机体内尽可能相似，有可能解决细胞退化问题。人血清/血浆是细胞在机体内赖以生存的“土壤”，所以加入一定比例的血清或血浆，可起到保持细胞形态完整性的作用。

本实验首先采用AB型血浆或血清，是因为AB型血清或血浆中不含有抗A、抗B抗体，尽可能减少血型抗体对实验结果的影响。然后，为验证血型抗体是否对结果有影响，采用O型血实验，结果显示不管是加入AB型，还是O型血清或血浆，均可避免细胞退化，保持细胞形态完整。从而验证了血型抗体对结果没有影响。在临床中可采用各种血型的血清或血浆进行实验，取材更加方便。为明确加入血清或血浆的最佳比例，分别按1∶1、2∶1、3∶1比例加入血清或血浆，发现按2∶1与3∶1比例结果相似，涂片后视野清晰，细胞形态完整，能够很好的进行细胞分类计数。

此改良方法优点在于，一方面在室温下就可完成整个操作过程，并不需要规范要求的4 ℃低温下进行。另一方面易取材、易操作、易推广、低成本、低消耗、临床实践性强。

[1]中华医学会呼吸病分会.支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范(草案)[J].现代实用医学, 2003,15(12):256-257.

[2]Kelch H,Hutter C.Clinical guidelines and indications for bronchoalveolar lavage (BAL): Report of the European Society of Pneumology Task Group on BAL[J]. Eur Respir J, 1990,3(8):937-974.

[3]Klech H,Pohl W.Technical recommendations and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL). Report of the European Society of Pneumology Task Group[J]. Eur Respir J, 1989,2(6):561-585.

[4]黄斌伦. 抗凝静脉血中白细胞形态变化观察[J]. 检验医学, 2005,20(2):156-157.

[5]尹卫东, 李立宏, 郭桢. EDTA盐抗凝血中白细胞形态的变化[J]. 张家口医学院学报, 1999,16(4):12.

[6]唐金凤, 肖九长, 林霖, 等. 改良涂片法和瑞氏-姬姆萨染色法对支气管肺泡灌洗液及痰嗜酸性粒细胞计数检测的比较[J]. 黑龙江医学, 2014,13(8):901-902.

[7]徐佳, 黄媛, 吴卫, 等. 改良支气管肺泡灌洗液细胞分类计数制片及染色法[J]. 临床检验杂志, 2014,32(2):98-101.

(本文编辑：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.06

马兴生，1965年生，男，主管技师，主要从事临床检验工作。

杨国儒，主任医师，E-mail：yangguoru@163.com。

R446

A

2016-12-08)