生物与物理复合法脱除棉籽粕中游离棉酚的工艺研究

卜小丽，程熠娜，王春维,2，陈 杰，祝家东，祝爱侠*

（1．武汉轻工大学生猪健康养殖湖北省协同创新中心，湖北武汉 430023；2．武汉轻工大学武汉市畜禽饲料工程技术研究中心，湖北武汉 430023）

生物与物理复合法脱除棉籽粕中游离棉酚的工艺研究

卜小丽1，程熠娜1，王春维1,2，陈 杰1，祝家东1，祝爱侠1*

（1．武汉轻工大学生猪健康养殖湖北省协同创新中心，湖北武汉 430023；2．武汉轻工大学武汉市畜禽饲料工程技术研究中心，湖北武汉 430023）

本试验旨在研究微生物固态发酵与微波降解分步复合法脱除棉籽粕中游离棉酚的加工技术。以棉籽浸出制油后的棉籽粕为原料，通过不同的菌种、接种量、料液比、发酵温度、发酵时间等影响因素进行试验分析，以棉籽粕的脱毒率为评判标准。首先通过确定正交试验的因素与水平，得出微生物固态发酵的最佳脱毒工艺参数；再以发酵后的湿棉籽粕为原料，采用微波降解工艺进行第二次物理辅助脱毒，确定最佳微波工艺参数；测定脱毒前后的棉籽粕粗蛋白含量和小肽含量。结果表明：混菌发酵比2∶1（枯草芽孢杆菌与酵母菌）、接种量10%、料液比2∶3、发酵时间48 h、发酵温度30℃，脱毒效果最佳，此时脱毒率高达86．57%；当微波时间和功率分别为6 min和3 000 W时，最终棉籽粕脱毒可达90．57%。测定脱毒后的棉籽粕粗蛋白含量为52．17%，提高了25．29%；小肽含量为11．13%，提高了20．19%。所得产品色泽均一，呈黑褐色，无酸臭味。微波过程可脱出一部分水分，有效节约了棉籽粕的烘干成本和烘干时间。此方法工艺简单、安全可靠、流程短、脱毒率高、水耗和能耗低，为棉籽粕的合理开发和利用提供理论基础和试验数据。

棉籽粕；游离棉酚；固态发酵；微波降解；脱毒条件

棉粕粗蛋白含量在38%～50%，是仅次于豆粕的世界第二大植物蛋白原料[1]。我国是世界上主要的产棉大国，年产棉籽饼粕在600万t以上，对其合理开发利用能够在一定程度上缓解我国蛋白资源的不足。但其含有的游离棉酚及环丙烯酸，尤其是游离棉酚会对畜禽造成损伤。动物摄入过量的游离棉酚，可与酶或其他蛋白质结合，不仅降低蛋白质消化率[2]，同时会使动物出现腹泻、厌食、红细胞数减少等中毒症状，严重的会导致肝脏和心肌变形坏死[3]；除此之外，游离棉酚可引起雄性动物的繁殖障碍，因此大大限制其在动物生产中的利用[4]。改善棉籽粕的营养价值，降低棉酚等抗营养物质，已成为棉籽粕蛋白资源推广运用的前提。现在常用的脱毒法分为物理法、化学法、微生物法。物理法和化学法往往存在成本高、适口性差、无法规模化生产、脱毒率低等问题。微生物发酵法成本低，无化学残留，且较安全，是目前常用的脱毒方法，但仍达不到较为理想的脱毒效果。微波可激发物料自身水分子的高速运动，极大地缩短热处理时间，与高温等脱毒法相比效率更高[5]。本研究旨在采用固态发酵和微波降解分步复合的方法对棉粕中的游离棉酚进行降解，确定最佳的降解工艺参数，为棉籽粕的合理开发和利用提供理论基础和试验数据。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．1．1 试验材料 棉籽粕原料由战友生物科技有限公司提供；棉酚标准品购于Sigma中国有限公司；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由武汉轻工大学实验室提供，酵母菌（Microzyme）购于安琪酵母有限公司；异丙醇、正己烷、冰乙酸、苯胺、3-氨基-1-丙醇、间苯三酚、丙酮为市售。

1．1．2 仪器设备 YB-1 000A分析天平（大连运邦科技发展有限公司）；Evolution 220紫外分光光度计（美国Thermo公司）；RC6 plus离心机（赛默飞世尔）；SFG-102立式压力蒸汽灭菌锅（宁波久兴医疗器械有限公司），WBS-10隧道式微波干燥设备（贵阳新奇微波工业有限公司）；S-3000N扫描式电子显微镜（日立）。

1．2 复合法工艺流程 选取新鲜棉籽粕→菌种、接种量、料液质量比、发酵温度、发酵时间单因素试验→正交试验→确定最佳发酵试验参数→微波降解脱毒法（时间、功率）→检测棉粕成分变化。

1．3 试验设计 将棉籽粕、玉米粉、麸皮按照7:2:1形成底物。自然pH的条件进行发酵试验，发酵后微波降解，并在65℃下烘干，粉碎过40目筛，以棉籽粕中游离棉酚含量为指标进行测定。

1．3．1 发酵单因素试验 ①菌种分别为枯草芽孢杆菌、酵母菌、两种菌种复配（枯草芽孢杆菌:酵母菌=1:1、1:2、2:1）。②接种量以6%、8%、10%、12%为单因素，初始含水率为60%，发酵温度30℃，发酵时间48 h。③初始含水率以50%、60%、70%、80%为单因素，接种量采用①的试验结果，发酵温度30℃，发酵时间48 h。④发酵温度以25、30、35、40℃为单因素，采用①、②的试验结果，发酵温度30℃，发酵时间48 h。⑤发酵时间以24、48、72、96 h发酵时间为单因素，接种量采用①的试验结果，初始含水率采用②的试验结果，发酵温度采用③的试验结果进行发酵试验。

1．3．2 发酵正交试验设计 试验设计见表1。

表1 棉籽粕发酵正交试验设计

1．3．3 微波降解研究 ①在确定最佳发酵工艺的基础上，以固态发酵正交试验得到最佳发酵条件。发酵后的湿基棉籽粕为原料，以1 000、2 000、3 000、3 500 W微波功率为单因素，微波4 min时进行微波辅助脱毒；②以2、4、6、8 min微波时间为单因素，在①基础上进行微波技术脱毒，确定不同微波时间对棉籽粕中游离棉酚脱毒工艺的影响。发酵结束后测定棉籽粕总蛋白、小肽含量和氨基酸变化。

1．4 测定指标及方法

1．4．1 棉酚含量测定 采用间苯三酚法[6]测定棉酚的含量。

1．4．2 扫描电镜观察发酵底物形态 通过扫描电镜观察固态发酵棉籽粕底物显微形态，观察枯草芽孢杆菌、酵母菌对棉籽粕的利用情况。

1．4．3 脱毒前后棉籽粕中粗蛋白质和小肽含量 采用GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白质测定方法》、GB/T 22492-2008《大豆肽相对分子质量的测定方法》，测定脱毒前后棉籽粕中蛋白和小肽的含量。

1．4．4 脱毒前后棉籽粕中氨基酸及氨基酸评分变化采用OPA柱后衍生法测定氨基酸含量[7]。

1．5 统计分析 本试验中不同处理试验结果采用Excel（2007）进行预处理，试验数据采用统计软件SPSS17．0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan’s多重比较检验，以P＜0．05为差异显著性标准；结果以平均值±标准差表示。

2 结 果

2．1 不同菌种对发酵棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响 由图1可知，枯草芽孢杆菌的发酵脱毒效果显著高于酵母菌（P＜0．05），但脱毒率均低于混菌发酵的脱毒效果；在混菌发酵时，枯草芽孢杆菌与酵母菌接种比例为2:1时脱毒率显著高于其他两组混菌发酵的效果（P＜0．05）。说明这两种菌协同性好，在同一个发酵环境下能较好的互利共生。因此根据以上试验结果对枯草芽孢杆菌与酵母菌接种比例为2:1进行复合发酵，以期找出复合发酵的最佳工艺条件。

2．2 接种量、含水率、温度、时间对发酵棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响 由图2可知，脱毒率随接种量、含水率、温度、时间增加均呈现先增大后降低的趋势，菌种接种量为10%时脱毒率最大。在接种量从6%增加到10%的过程中，脱毒率明显增加。但当接种量大于10%后，脱毒率反而下降。在一定范围内，含水率越高，棉酚降解率越高。含水率为60%时脱毒率最高，且含水率从50%增加到60%时，脱毒率明显增大。在温度由25℃增加到30℃时脱毒率明显增加，且在发酵温度为30℃时脱毒率最高，当发酵温度高于35℃时，脱毒率明显下降。在发酵24 h时，脱毒率不足40%；在发酵48 h时脱毒率达到最高，随着发酵时间的增加，脱毒率略有下降的趋势。

图1 不同菌种发酵棉籽粕对其游离棉酚脱率的影响

2．3 固态发酵法脱除游离棉酚的正交试验结果 从表2结果可以得出，对发酵棉籽粕中游离棉酚含量的影响因素主次是D＞A＞B＞C，即发酵时间＞接种量＞初始含水率＞发酵温度。最佳方案是A2B2C1D2，未在试验组合中，所以对该组合做验证试验，结果显示脱毒率为86．57%，高于正交试验中的最高脱毒率85．89%，因此确定最佳工艺组合为A2B2C1D2，即接种量为10%、初始含水率为60%、发酵温度为30℃、发酵时间为48 h。

2．4 微波降解脱毒法脱除游离棉酚的工艺优化 由图3可知，脱毒率随着微波功率和时间增加均呈现先增大后减少的趋势。微波功率为3 000 W时的脱毒率显著高于1 000 W的脱毒率（P＜0．05），其余微波功率组之间均没有显著性差异（P＞0．05）；但从数值上看，在微波功率达到3 000 W时，脱毒率达到最大。微波6 min的脱毒率显著高于2 min的脱毒率（P＜0．05），随着微波时间的增加，脱毒率并没有显著变化（P＞0．05）。从数值上来看，6 min脱毒率最高。

2．5 脱毒前后棉籽粕变化

图2 不同接种量、含水率、温度、时间对棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响

图3 微波功率、时间对游离棉酚脱毒率的影响

表2 棉籽粕发酵正交试验

图4 固态发酵棉籽粕形态

2．5．1 扫描电镜观察固态发酵棉籽粕形态 由图4可知，酵母菌、枯草芽孢杆菌在棉籽粕底物中很好的生长，同时由图4 b观察到经过2种菌混合发酵后，棉籽粕底物被分解得更加彻底，表明这两种菌具有协同生长、共同利用棉籽粕底物的作用。

2．5．2 脱毒后棉籽粕中粗蛋白质、小肽含量变化 由表3可知，利用复合法脱毒后的棉籽粕蛋白质和小肽均有显著提高（P＜0．05）。脱毒后棉籽粕中蛋白质含量提高了25．29%，小肽含量提高了20．19%。

2．5．3 脱毒前后棉籽粕中氨基酸的变化 由表4可以看出，脱毒后所测棉籽粕中必需氨基酸含量由脱毒前的9．95 nmol/mL提高到11．45 nmol/mL，非必需氨基酸含量与脱毒前比较也有提高。其中苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸均有显著性提高（P＜0．05）。必需氨基酸苏氨酸提高14．6%，缬氨酸提高18．35%，蛋氨酸提高提高21．43%，异亮氨酸提高19．59%，亮氨酸提高15．81%，苯丙氨酸提高12．22%，赖氨酸提高11．81%。

表3 发酵后棉籽粕营养成分变化 %

3 讨 论

3．1 接种量、含水率、温度、时间对发酵棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响

3．1．1 接种量对发酵棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响 菌种的接种量在固态发酵中是一个很重要的因素[8]。接种量过少，则菌体生长缓慢、代谢少，在限定的时间内游离棉酚降解率低。而接种量过高，导致发酵营养物质消耗过快，后期菌体长势不明显，不利于产物的形成和毒性物质的降解；同时培养基粘度大、易结块，导致氧气交换受到限制，菌种生活力不断衰退，增加了杂菌污染的机会[9]。本试验中，适量接种量为10%，脱毒效果较好。

表4 复合法脱毒前后棉籽粕中氨基酸的变化

3．1．2 含水率对发酵棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响 底物的含水率对微生物的生长及其代谢能力有重要影响。本试验结果与刘国娟等[10]研究结果相同。含水率低会降低营养物质的溶解性、酶的稳定性和微生物的生长，进而降低脱毒效果[10]；含水率过高，发酵物料颜色过深，气味变差，脱毒率下降，不利于菌体的生长和发酵物料的干燥。其原因可能是发酵物料中含水量过高会使底物粘度增大、易结块、通气差、易染菌[11]，限制了氧的传递和细胞的氧需求，影响菌体生长。本试验表明，含水率为60%时脱毒率最高。

3．1．3 温度对发酵棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响复合菌种的生长和代谢对温度具有敏感性[12]。温度是保证菌种生长和产物合成的重要因素，是固态发酵的关键控制点。本试验结果表明，在发酵温度为30℃时脱毒率最高，这与金红春[13]用微生物发酵脱毒棉粕及在青鱼养殖上的利用研究结果一致。发酵温度达到37℃时不适合酵母菌的生长；同时温度过高，芽孢杆菌会启动自我保护机制，形成芽孢，不利于菌体的生长代谢，进而对棉粕脱毒的生化和代谢产生不利影响。而且固态发酵传热效果较差，会造成培养基局部温度过高而导致菌体死亡，降低棉酚脱毒率。

3．1．4 发酵时间对发酵棉籽粕中游离棉酚脱毒率的影响 在发酵48 h时脱毒率最高，延长发酵时间并不能增大脱毒率，这与朱德伟等[8]研究结果一致。在发酵前期，脱毒率明显增加，因在24～48 h菌体处于对数期，菌体生长迅速、代谢旺盛产物多，脱毒率增加明显。但当发酵时间超过96 h后，脱毒率略有下降趋势，由于过长的发酵时间，基质被过度消耗，而菌体过了稳定期后，单位时间产生的代谢产物减少，杂菌的继续生长又消耗底物，进而使脱毒率降低。但发酵时间太短，不足以到达菌体的生长对数期，影响菌体的脱毒作用。因此，在发酵时间为48 h时，脱毒效果较好。

3．2 微波降解法脱除游离棉酚的工艺优化 在输出功率达到3 000 W时，脱毒效果最好。在微波时间为6 min时，脱毒率最高。可能由于微波加热作用，使棉籽粕温度迅速增加，从而破坏棉籽粕中游离棉酚结构，或游离棉酚在经过微波后与蒸发的水分一起被释放。同时微波处理是一种重要的蛋白改性方式，其与传统制油工艺中采用的高温蒸炒压榨技术较为相似。研究资料表明，微波处理可有效降解棉籽蛋白中的各个亚基，并提高其在动物消化道内的利用率[5]。由固态发酵法和微波技术方法复合脱毒后，制得的棉籽粕产品的脱毒率达到90．57%，原料中棉酚含量仅为72 mg/kg，远远低于国家饲料标准值300 mg/kg[14]，属于低酚棉籽粕。

3．3 脱毒后棉籽粕形态/粗蛋白质、小肽和氨基酸含量变化 脱毒后的棉籽粕蛋白质提高了25．29%，小肽含量提高了20．19%。说明在发酵过程中棉籽粕经枯草芽孢杆菌、酵母菌分泌的蛋白酶使得发酵后棉籽粕蛋白质含量提高，发酵使其中部分大分子蛋白质分解为小分子肽，提高营养物质的消化吸收率，改变饲料蛋白质品质，产生促生长因子改善棉籽粕饲料的适口性[15]。蛋白质以小肽形式直接吸收有很多优点：肽之间的运转不存在竞争性和抑制性，吸收小肽和氨基酸的机制是彼此独立，互不干扰的，且小肽所占比例越大，越有较好的吸收效果。

4 结 论

在本试验条件下，通过单因素和正交试验研究得出，当枯草芽孢杆菌与酵母菌以2:1进行复合发酵，最优发酵工艺参数为接种量10%、初始含水量60%、发酵时间48 h、发酵温度30℃，此时脱毒率可达86．57%。以发酵后棉籽粕为原料，采用微波辅助脱毒，工艺条件是微波功率3 000 W、微波时间6 min，棉籽粕中游离棉酚脱毒率可达90．57%，发酵后游离棉酚含量仅为72 mg/kg。

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S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-079

2016-07-22；

2016-08-13

湖北省教育厅科研项目（Q20141706）

卜小丽（1989-），女，河南商丘人，在读研究生，动物营养与饲料科学专业，研究方向为饲料添加剂及资源开发与利用，E-mail: syrlbxl@163．com

* 通讯作者：祝爱侠，博士，E-mail: zhuaixia807@163．com