体外产气法评价辣木叶与玉米的组合效应

曹 凯，张 勇，王雁坡，汤志宏，杨 怡，朱宁宁，赵 成*

（1．浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2． 浙江大学创新技术研究院，浙江杭州 310007）

体外产气法评价辣木叶与玉米的组合效应

曹 凯1，张 勇1，王雁坡1，汤志宏1，杨 怡1，朱宁宁2，赵 成2*

（1．浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2． 浙江大学创新技术研究院，浙江杭州 310007）

本试验旨在以苜蓿为对照研究辣木叶与玉米的组合效应。辣木叶/苜蓿与玉米分别按100:0、80:20、60:40、40:60、20:80、0:100的比例进行组合，采用体外发酵法研究不同组合间的体外发酵参数及其组合效应值的变化。结果表明：随着玉米比例的升高，两组培养液pH、氨态氮（NH3-N）浓度和乙丙比均呈下降趋势，而乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸（TVFA）、48h产气量（48 h GP）和潜在产气量逐渐升高；辣木叶组和苜蓿组的pH、48 h GP和丁酸无差异（P＞0．05），TVFA、乙酸、丙酸、产气速率和有机物消化率（OMD）极显著高于苜蓿组（P＜0．01）；辣木叶组的48 h GP和微生物蛋白（MCP）组合效应值以及综合组合效应值（AEs）与苜蓿组无差异（P＞0．05），TVFA、乙酸和NH3-N的组合效应值显著高于苜蓿组（P＜0．05）；以48 h GP、NH3-N、MCP、TVFA浓度和OMD的组合效应值以及综合组合效应值AEs为主要衡量指标，辣木叶与玉米的组合比例为60:40时，正组合效应达到最大。从本试验结果可以得知，辣木叶是一种与苜蓿营养价值相当的粗饲料资源，辣木叶与玉米比例为60:40时的饲料利用效率最高。

辣木叶；玉米；苜蓿；组合效应

近年来，我国优质粗饲料资源严重短缺且价格昂贵，已经成为制约反刍动物养殖业发展的主要因素。辣木作为一种起源于印度北部的热带、亚热带植物，具有产量高、适应性广、栽培简便、抗逆性强及营养丰富等特点[1]。对于反刍动物来说，每100 g辣木叶含粗蛋白质25．7 g、脂肪2．3 g、水分6．9 g、粗纤维19．2 g、粗多糖15．9 g、钙1．54 g和磷0．14 g[2]，符合优质粗饲料的要求。目前，有关辣木叶应用于反刍动物饲养的报道较少。Aregheore等[3]将不同比例辣木鲜叶与有芒鸭嘴草（原变种）混合肥育山羊，发现添加20%、50%辣木鲜叶可显著提高山羊的干物质采食量、平均日增重、中性洗涤纤维和粗蛋白质的消化率。Luuhm 等[4]认为辣木叶粉可作为单一的山羊饲粮，在饲喂后干物质采食量、反刍率及消化率方面同饲喂银合欢叶无显著差异。由于辣木叶具有高蛋白的特点，本试验通过体外产气技术以苜蓿作参照研究辣木叶与常用的能量饲料玉米的优化组合，利用多项发酵参数、产气参数以及组合效应指标来确定最优的搭配组合，明确辣木叶的经济效益，为辣木叶饲料化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 试验时间及地点 试验于2015年8月至12月在浙江大学奶业科学研究所进行。

1．2 供试样品 辣木叶由福建厦门天竺辣木有限公司提供，采自2015年6月。苜蓿草、玉米从市场购入。

1．3 供试瘤胃液 取自3头装有瘤胃瘘管的湖羊，4层纱布过滤，39℃水浴保温，并连续冲入CO2备用。

1．4 供试人工唾液 人工唾液按Menke等[5]的方法配制。

1．5 试验设计 试验分为6个处理：辣木叶（或苜蓿）与玉米分别以100:0、80:20、60:40、40:60、20:80、0:100的比例组合。每个组合3个重复。试验采用Mauricio等[6]的压力读取式体外产气系统（Reading Pressure System, RPT）进行体外瘤胃发酵培养。按不同处理的底物比例准确称入500 mg的底物至120 mL产气瓶中，在持续通入CO2气流下加入45 mL人工唾液，密封后在39℃恒温培养箱中预处理培养12 h。次日早晨抽取用4层纱布过滤后的瘤胃液5 mL加入到产气瓶中，同时设空白对照和标准羊草对照，每个处理4个重复，培养时间分别为48 h，试验重复2次。

1．6 测定指标及方法

1．6．1 样品常规营养成分 供试饲料测定干物质（DM），粗蛋白（CP）用凯氏定氮法测定，粗脂肪（EE）用抽滤法测定，粗灰分（Ash）按高温灰化（550℃）的方法测定，有机物（OM）为绝干重去除粗灰分部分，钙（Ca）用高锰酸钾法测定、磷（P）用比色法测定[7]，中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）按Van Soest法测定[8]。

1．6．2 pH 发酵终止后，使用SartoriusPB-20型pH计测定。

1．6．3 挥发性脂肪酸 使用气相色谱仪（GC-2010，Shimadzu）测定乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸（TVFA）的含量。

1．6．4 产气量和体外有机物消化率 根据段智勇[9]的方法计算产气量和有机物消化率（OMD）。

1．6．5 氨态氮 取上清混合液，采用比色法测定NH3-N浓度[10]。

1．6．6 微生物蛋白 采用Makkar等[11]的试验方法，用嘌呤法测定微生物蛋白（MCP）产量。以嘌呤为微生物蛋白产量的标志，采用紫外分光光度计通过比色法测定嘌呤，一方面瘤胃微生物内嘌呤氮所占的比例是恒定的，另一方面所有饲料来源的RNA和DNA在瘤胃内几乎全部被降解。微生物蛋白在加热条件下经HClO4氧化，分离成游离碱基和环状氨基酸，游离碱基再与硝酸银结合生成硝酸银嘌呤络合物沉淀，然后与HCl反应生成可溶性的游离氨基酸和AgCl沉淀。可溶性的游离碱基在波长260 nm紫外光条件下比色，从而测得嘌呤浓度。

1．6．7 组合效应值和综合组合效应值 根据苏海涯[12]的方法计算组合效应值和综合组合效应（AEs）值。

组合效应值（%）=（实测值-加权估算值）/加权估算值×100

式中，实测值为实际测定的样品生产量（mL），加权估算值＝玉米的实测值×玉米配比（%）＋辣木叶/苜蓿实测值×辣木叶/苜蓿配比（%）。

综合组合效应值(%)=[GP实测值/GP加权估算值×SUBGP/（SUBGP+SUBMCP）+MCP实测值/MCP加权估算值×SUBMCP/（SUBGP+SUBMCP）-1]×100

式中，GP实测值、MCP实测值分别为实际测定的产气量（mL）和微生物蛋白生成量（mg）；加权估算值＝玉米的实测值×玉米配比（%）＋辣木叶/苜蓿实测值×辣木叶/苜蓿配比（%）；SUBGP为用于生成气体所需的饲料底物样品数量（mg），SUBGP=2．27（mg/mL）×GP（mL），其中2．27为每生成1 mL气体平均所需的饲料底物样品数量（Blummel等[13]，2．20 ～2．34 mL）；SUBMCP为用于生成微生物所需的饲料底物样品数量（mg），SUBMCP=微生物蛋白质（mg）/0．625，其中0．625为微生物干物质中蛋白质的含量（Russell等[14]）。1．7 统计分析 试验数据用SAS 9．2软件处理，用GLM模型进行二因素方差分析，采用邓肯法进行多重比较。

2 结果与分析

2．1 供试饲料常规营养成分 辣木叶、苜蓿、玉米的常规营养成分见表1。

2．2 辣木叶/苜蓿与玉米组合对发酵参数的影响由表2可知，不同处理之间的发酵参数差异极显著（P＜0．01）。随着玉米比例的增加，乙酸、丙酸、丁酸、TVFA生成量同步上升，但乙丙比逐渐下降，同时pH、NH3-N浓度也有下降的趋势。辣木叶组与苜蓿组对比中，辣木叶组MCP、乙丙比和NH3-N浓度极显著低于苜蓿组（P＜0．01），苜蓿组乙酸、丙酸极显著低于辣木叶组。辣木叶组TVFA显著高于苜蓿组（P＜0．05），两组pH和丁酸无差异。除了TVFA、乙酸和丙酸，其他参数上均无交互作用。上述结果表明，辣木叶作为一种粗饲料资源，其综合品质与苜蓿相当，同时辣木叶按一定比例与玉米进行组合能够提高VFA和MCP的生成量，并通过降低乙丙比，改变瘤胃发酵模式，从而提高辣木叶的利用率。

表1 饲料原料的常规营养成分（绝干基础）

表2 辣木叶/苜蓿与玉米组合对发酵参数的影响 %

表3 辣木叶与玉米组合对产气参数及组合效应的影响 %

2．3 辣木叶与玉米组合对组合效应的影响 由表3可知，不同处理之间的产气参数均出现差异极显著（P＜0．01）。当辣木叶/苜蓿与玉米的比例为20:80时，48 h GP、a+b、c和OMD均极显著高于其他组（P＜0．01），与苜蓿相比，辣木叶组a+b、c和OMD极显著高于苜蓿组（P＜0．01）。对于综合组合效应值，辣木叶/苜蓿与玉米的组合中都是比例为60:40时最高，而OMD、48 h GP的组合效应值与其并不一致。辣木叶组TVFA和NH3-N的组合效应值极显著高于苜蓿组（P＜0．01），苜蓿组OMD的组合效应值极显著高于辣木叶组，48 h GP、MCP的组合效应值以及综合组合效应值两组无差异（P＞0．05）。所有的产气参数均有极显著的交互作用（P＜0．01）。而NH3-N、MCP和OMD组合效应均无交互作用（P＞0．05）。48 h GP、TVFA、AEs组合效应有显著的交互作用（P＜0．05）。以上结果表明，辣木叶在产气参数上略优于苜蓿，以48 h GP、TVFA、NH3-N、MCP和OMD的组合效应值以及综合组合效应值为主要指标，辣木叶与玉米的比例60:40时为最优组合。

3 讨 论

3．1 辣木叶/苜蓿与玉米组合对pH、NH3-N浓度、MCP浓度及组合效应的影响 瘤胃pH是反映瘤胃内环境的一个综合指标，只有在适宜的pH下，粗饲料中的纤维物质才能够被充分消化。瘤胃中大多数细菌的最适pH值在6．0以上。Depeters等[15]研究表明，瘤胃pH在6．6～6．8可以保证纤维分解菌的正常活动。本试验中，随着玉米比例的增加，两组培养液pH均呈下降趋势，因为碳水化合物分解产生的挥发性脂肪酸能够引起pH的下降，从而表明碳水化合物是影响瘤胃参数的一个重要因素。与林奕等[16]研究结果相一致，同时试验结果表明，不同的玉米比例对pH值的影响是极其显著的，随着玉米比例的增加，更多碳水化合物的加速分解使得pH值降低，从而在饲料日粮配制过程中可以通过改变玉米的比例实现对pH的调控。

NH3-N是瘤胃代谢过程中重要的组成部分，一方面是瘤胃中饲料分解的终产物之一，另一方面是瘤胃微生物自身蛋白合成的原料。McDonald等[17]认为，瘤胃最佳的NH3-N浓度在5～25 mg/dL。本试验中各组NH3-N浓度范围在12．83～18．9 mg/ dL，在文献报道范围之内。NH3-N浓度受到多方面的影响，主要包括日粮蛋白质水平、日粮蛋白质在瘤胃内的降解率、瘤胃对NH3-N的吸收利用以及外排等。随着玉米比例的增加，蛋白质水平逐渐降低。两组培养液NH3-N浓度呈现下降趋势。辣木叶/苜蓿与玉米的组合均在100:0时NH3-N浓度显著高于其他组，辣木叶与玉米组合比例为60:40时，NH3-N的组合效应值最高，苜蓿与玉米的组合中，组合效应值最高的出现在比例80:20时。可能因为不同底物的最佳营养配比不同，在最佳配比下，培养液中蛋白分解菌的作用效果最好，从而NH3-N浓度最高。

MCP浓度能够反映发酵体系中微生物种群数量和微生物对NH3-N的利用能力[18]。能量和蛋白质是维持微生物生长的主要营养物质，当反刍动物所需的能氮比例适宜时，瘤胃微生物合成MCP的效率能够最大限度的提高[19]。本试验中，随着玉米比例的增加，2组培养液的MCP浓度都经历一个先升高再降低的过程，并且都是在比例为60:40时达到最大浓度。表明该组辣木叶/苜蓿与玉米的能氮比例是所有组合里面最好的。同时两组的MCP浓度均产生了正组合效应，辣木叶与玉米的最大组合效应值出现在比例为60:40时，而苜蓿与玉米的则出现在比例为80:20时。在适宜的能氮比例下，底物为微生物提供了较充足的氮源，从而有效地提高了瘤胃微生物蛋白合成效率。

3．2 辣木叶/苜蓿与玉米组合对VFA、GP及组合效应的影响 瘤胃液中的VFA是反刍动物碳水化合物在瘤胃中降解的主要产物，与能量代谢密切相关。乙酸在瘤胃TVFA中所占比例很高，是反刍动物合成脂肪的重要前体物质。丙酸一方面在体内碳水化合物的中间代谢过程中发挥着重要的作用；另一方面作为瘤胃挥发性脂肪酸中唯一能生糖的挥发性脂肪酸，丙酸的糖异生作用为反刍动物提供了绝大部分的葡萄糖。不同的乙丙比代表了瘤胃的不同发酵模式。本试验中随着玉米比例的增加，2组培养液中的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸都逐渐增加，当玉米比例达到最大时，乙丙比降到最低。TVFA、乙酸、丙酸和丁酸都极显著地高于其他组，但并没有随着玉米比例的增加而呈线性增加，从而表明在挥发性脂肪酸的各项指标中存在组合效应，辣木叶与玉米的组合中，TVFA的生成均产生了正组合效应，并且当辣木叶与玉米的配比接近时组合效应值最大，表明底物中可降解碳水化合物水平较适宜，然而在苜蓿与玉米的组合中，TVFA的生成均产生了显著的负组合效应。

研究表明，体外产气量和化学成分结合估算的消化率与体内法测定的消化率高度相关，而体外瘤胃发酵的产气量与反刍动物饲料体内消化率呈正相关[13]。饲粮中可发酵的有机物含量直接关系到产气量的高低。本试验中当辣木叶/苜蓿与玉米的比例为20:80时，48 h GP、潜在产气量和产气速率都极显著地高于其他比例，表明该比例下底物的消化率达到最高，这与段智勇[9]的研究结果一致，这是由于该组精料所占比例最高，而精料易于消化，从而产气量最高。本试验中，辣木叶/苜蓿与玉米的48 h GP组合效应均不是很明显，大部分出现了微弱的负组合效应，并且各组之间差异不显著，可能是由于发酵条件不同导致。

研究表明，能量与蛋白的比例和使用量对粗饲料纤维的利用率影响很大，是产生组合效应的一个主要原因[20]。能氮平衡是保证瘤胃内微生物充分发挥降解作用的重要条件。饲粮中不同水平的蛋白质需要对应相应水平的能量，才能够充分发挥作用。本试验中，辣木叶/苜蓿与玉米的组合均是在比例为60:40时AEs最大，表明在该比例下，底物中饲料原料之间的组合是比较合理的，保证了能氮的相对平衡，从而最大程度上提高了瘤胃发酵和饲料利用效率。

4 结 论

在本试验条件下，辣木叶/玉米组合与苜蓿/玉米组合的各项发酵参数、产气参数及组合效应差异不显著，部分指标优于苜蓿/玉米组合，表明辣木叶是一种营养价值与苜蓿相当的粗饲料。当辣木叶/玉米组合比例为60:40时，能氮平衡较为合理，正组合效应达到最大，为最优组合，可提高辣木叶的利用效率。因此，辣木叶是一种优质的反刍动物饲料资源，值得开发与利用。

[1] 吴由页, 蔡志华, 魏烨昕, 等. 辣木作为新型植物性蛋白质饲料的研究进展[J]. 动物营养学报, 2013, (3):503-511.

[2] 饶之坤, 封良燕, 李聪,等. 辣木营养成分分析研究[J].现代仪器, 2007, (2):18-20.

[3] Aregheore E M. Ⅰntake and digestibility of Moringa oleiferabatiki grass mixtures by growing goats[J]. Small Rum Res, 2002, 46(1):23-28.

[4] Luu H M,Nguyen N X D,Tran P N. Ⅰntroduction and evaluation of Moringa oleifera for biomass production and as feed for goats in the Mekong delta[J]. Livest Res Rural Dev, 2005179:138-143.

[5] Menke K H, Steingass H. Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[J]. Anim Rea Dev, 1988, 28:7-55.

[6] Mauricio R M, Owen E, Dhanoa M S,et al. Comparison of rumen liquor and faeces from cows as source of microorganisms for the in vitro gas production technique[A].Ⅰn: Ⅰn vitro techniques for measuring nutrient supply to ruminants, Proceedings of Occasional Meeting of the British Society of animal Science[C]. UK: University of Reading, 1997.

[7] 杨胜. 饲料分析及饲料质量检测技术[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 1993:16-35.

[8] Van Soest P J, Robertson J B, Lewis B A. Methods for dietary fiber,neutral detergent fiber, and non-starch polys -accharides in relation to animal nutrition[J]. J Dairy Sci, 1991, 74(6):3583-3597.

[9] 段智勇. 反刍动物日粮中淀粉与纤维的组合效应及其机理的研究[D].杭州:浙江大学, 2006: 53-57.

[10] Moss A R, Jouany J P, Newbold J. Methane production by ruminants: its contribution to global warming[J]. Ann Zootech, 2000, 49(3):231-253.

[11] Makkar H P S, Becker K. Purine quantification in digesta from ruminants by spectrophotometic and HPLC methods[J]. Brit Nutr, 1999, 81: 107-112.

[12] 苏海涯. 反刍动物日粮中桑叶与饼粕类饲料间组合效应的研究[D].杭州: 浙江大学, 2002:28-34.

[13] Blümmel M, Makkar H P S, Becker K. Ⅰn vitro production: A technique revisited[J]. J Anim Physiol An N, 1997, 77: 24-34.

[14] Russell J B, Connor J D O, Fox D G,et al. A net carbohy -drate and protein system for evaluating cattle diets:Ⅰ. Ruminal fermentation[J]. Anim Sci, 1992, 70:3551-3561.

[15] DePeters E J, Bath D L. Canola meal vensus cottonseedmeal as the protein supplement in dairy diets[J]. Dairy Sci, 1986, 69:148-154.

[16] 林奕. 白酒糟、玉米和豆粕之间组合效应及其对瘤胃发酵特性影响的研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2009: 18-21.

[17] McDonald P R A. The inf l uence of conservation methods on digestion and utilization of forages by ruminants[J]. Proc Nutr Soc, 1976, 35: 201-211.

[18] 彭点懿. 不同品质粗饲料组合对体外发酵参数,夏季奶牛生产性能及血液生化指标的影响[D]. 雅安: 四川农业大学, 2010.

[19] 王旭. 利用GⅠ技术对粗饲料进行科学搭配及绵羊日粮配方系统优化技术的研究[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2003.

[20] 郭旭生. 秸秆生化复合处理技术与系统营养调控在肉羊日粮配制中的应用研究[D]. 银川: 宁夏大学, 2004: 88-91.

Evaluation of Associative Ef f ects of Moringa Oleifera Leaves and Corn by Using anin vitroGas Production Technique

CAO Kai1, ZHANG Yong1, WANG Yan-po1, TANG Zhi-hong1, YANG Yi1, ZHU Ning-ning2, ZHAO Cheng2*
(1.College of Animal Sciences, Zhejiang University, Zhejiang Hangzhou 310058, China; 2.Zhejiang University Ⅰnnovation Technology Research Ⅰnstitute Co., Ltd. Zhejiang Hangzhou 310007, China)

This experiment was conducted to study the associative effect of Moringa oleifera leaves and corn in comparison of alfalfa. Moringa oleifera leaves and alfalfa both mixed with corn in the proportions of 100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 and 0:100. Rumen fermentation parameters and associative ef f ects of the fermented mixtures were evaluatedin vitroby reading pressure system techinique (RPT) to determine the best combination. As a result, rumen pH, NH3-N and the ration of acetate and propionate were decreased with the rise of the ratio of corn, but the yield of acetate, propionate, byrate, VFA, total gas production and potential gas production were increased. There were no significant dif f erences between Moringa oleifera leaves group and alfalfa group in the associative ef f ects of gas production, MCP and the synthetic associative ef f ect(AEs).However TVFA, the yield of acetate and NH3-N in the Moringa oleifera leaves group were signif i cantly higher than those in the alfalfa group(P＜0.05). While the associative ef f ects of gas production, NH3-N, MCP, TVFA, OMD and the synthetic associative ef f ect(AEs) were used as the evaluation indexes, the value of associative ef f ects of the group with corn at proportion 40 and Moringa oleifera leaves at proportion 60 reached the peak(P＜0.01).Ⅰn summary, Moringa oleifera leaves is a coarse feed resource of which the nutrient value is equal to the alfalfa, and feed efficiency tended to be the highest when the ratio of corn and Moringa oleifera leaves is 60:40.

Moringa oleifera leaves; Corn; Alfalfa; Associative ef f ects

S827.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-073

2016-07-13；

2016-08-14

辣木枝、叶用于家畜饲料的应用技术研发（15-518004-005）

曹凯（1992-），男，安徽安庆人，在读硕士，研究方向为粗饲料资源的开发与利用，E-mail:aiock@foxmail．com

* 通讯作者：赵成，E-mail: zhaoc@zjuiti．com