超临界流体色谱-四极杆飞行时间质谱快速分析牛奶与羊奶中的甘油三酯组分

涂安琪，杜振霞

(北京化工大学分析测试中心，北京 100029)

超临界流体色谱-四极杆飞行时间质谱快速分析牛奶与羊奶中的甘油三酯组分

涂安琪，杜振霞

(北京化工大学分析测试中心，北京 100029)

建立了超临界流体色谱-四极杆飞行时间质谱(SFC-Q-TOF-MS)联用技术快速分离及识别牛奶与羊奶中复杂甘油酯成分。采用BEH 2-EP色谱柱，以甲醇-乙腈-甲酸(50∶50∶0.1，V/V/V)为流动相，共分离并识别了55种甘油三酯和16种甘油二酯。实验结果表明，牛奶脂与羊奶脂有相似的甘油三酯组成系列，但是甘油三酯相对含量差异较大，羊奶中不饱和脂肪酸构成的甘油三酯含量更高。利用主成分分析(PCA)法对两类样品进行统计学分析，明显区分了牛奶和羊奶样品，并找出了二者的主要差异性物质。该方法快速有效、绿色环保，有利于全面了解牛奶脂与羊奶脂中甘油酯的组成，也可为快速判断奶源类型提供技术支持。

超临界流体色谱；四极杆-飞行时间质谱；甘油三酯；主成分分析；牛奶；羊奶

哺乳动物乳汁是非常复杂的食品基质，含有多种营养物质，如碳水化合物、蛋白质、脂质等[1]。物种、基因、环境条件及哺乳周期都会影响这些营养物质的化学组成[2]。甘油三酯(Triacylglycerols, TAG)是酶催化下一分子甘油与三个脂肪酸分子酯化的产物，是乳汁中含量最高的脂类组分，占总脂肪的98%以上，其组成影响奶制品的物理性质和营养价值[3]。但由于脂肪酸的碳数、双键数和构型的区别，使得自然界存在的脂肪酸种类众多，而且当游离脂肪酸酯化到甘油分子骨架的不同位置，即sn-1位、sn-2位和sn-3位，会形成位置异构体。因此，天然油脂中的甘油酯组成非常复杂，且结构类似，所以对TAG的分析具有很大的挑战性。

目前，国内外分析TAG的方法有气相色谱法和高效液相色谱法等。Silva等[4]采用气相色谱法测定了巴西人乳脂组成，并通过饮食习惯解释了多地人乳脂差异的原因。Lísa等[5]通过串联两根ODS色谱柱至总柱长45 cm，以乙腈-异丙醇为流动相，在无水反相色谱-大气压化学电离质谱联用的条件下，测定了植物油中13种甘油三酯组成，具有很高的分辨率，共识别出264种TAG。虽然气相色谱法与高效液相色谱法在分析各种基质中的TAG组成方面取得了很多进展，但仍存在一些局限，如采用气相色谱法分析TAG时需要对分析物进行衍生化，操作复杂费时，且只能得到TAG的脂肪酸组成，而不能得到脂肪酸酯化位置的信息；而高效液相色谱法分析复杂的TAG成分通常需要较长的运行时间(一般长达60～200 min)。

超临界流体色谱以超临界流体(通常为超临界CO2)作为流动相，现代的超临界流体色谱允许加入少量有机溶剂作为改性剂，以增强流动相的极性与洗脱能力。与常规液相色谱相比，超临界流体色谱具有独特的优势和性能：一方面，超临界流体的黏度接近于气体，拥有很高的扩散系数，允许大流速而不会引起过大的压降，可保证分析效率；另一方面，超临界流体在密度与溶解力上与液体性质类似，对分析物具有较好的溶解性和转移能力，可保证超临界流体色谱卓越的分离能力[6]；此外，超临界CO2是一种绿色安全的试剂，可大幅减少有机溶剂所带来的环境污染及健康危害，近年来得到了广泛关注。Lee等[7]以反相ODS色谱柱为固定相，分离了不同大豆样品中的甘油三酯，并通过变换单重四极杆质谱锥孔电压进行定性分析，在8 min内识别了18种甘油三酯，并在后续研究中表明超临界色谱也可以分离甘油三酯的位置异构体[8]。

本实验拟采用超临界流体色谱-四极杆飞行时间质谱分离检测牛奶和羊奶中的甘油三酯，并根据实验结果对这两种哺乳动物乳汁的TAG组成特点进行归纳总结，利用主成分分析法进行统计学分析，希望得到两类样品主要的差异性物质，以进一步了解牛奶和羊奶脂肪组成的区别。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱、Xevo®G2-S四极杆飞行时间质谱仪：美国Waters公司产品；GP225D电子天平：德国Sartorius公司产品。

高纯二氧化碳：纯度≥99.999%，北京如源如泉科技有限公司产品；甲醇、乙腈：质谱纯，美国Fisher公司产品；正己烷：色谱纯，美国Fisher公司产品；甲酸：色谱纯，美国Tedia公司产品；牛奶样品与羊奶样品：均购自北京当地超市。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件 Acquity UPC2BEH-2EP色谱柱(100 mm×3.0 mm×1.7 μm)，柱温50 ℃，背压1.1×104kPa；流动相：A为超临界CO2，B为甲醇-乙腈-甲酸溶液(50∶50∶0.1，V/V/V)；梯度洗脱程序：0～2 min保持0.1%B，之后4 min内由0.1%B线性升至1%B，再在3 min内线性升至2%B，保持6 min，接下来的5 min内由2%B线性升至7%B，再在4 min内线性升至20%B，在0.5 min内返回初始流动相比例0.1%B，并保持1 min；流速1.0 mL/min；样品进样量1 μL；整个分析过程持续25 min。

1.2.2 质谱条件 电喷雾电离源正离子模式(ESI+)，在MSE模式下采集m/z50～2 000范围内的物质；去溶剂气为氮气，流速800 L/h；去溶剂温度450 ℃；源温120 ℃；毛细管电压3.0 kV；锥孔气流速20 L/h；锥孔电压25 V；碰撞气为氩气；低碰撞能量4 eV，高碰撞能量20～60 eV；数据采集软件为Waters UNIFI。

本实验采用的MSE采集模式可以实现一针进样后同时提供两个质谱扫描模块。第一个质谱扫描功能采用较低的碰撞能量，从而提供前驱离子的精确质量信息；在第二个质谱扫描模块中采取从低到高变化的碰撞能量，能够提供丰富的碎片离子信息。

1.3 样品前处理

准确量取1 mL牛奶或羊奶样品至10 mL塑料离心管中，加入2 mL正己烷萃取剂，于室温下涡旋离心2 min，然后以8 000 r/min离心10 min，静置分层，取上清液，过0.22 μm尼龙滤膜，滤液置于样品瓶中，待测。

1.4 统计学分析

实验检测了12个样品，包括8个牛奶样品与4个羊奶样品。将所得的液相色谱-质谱数据进行主成分分析(PCA)。首先，用Markerlynx v4.1预处理软件自动检测SFC-Q-TOF-MS原始数据每个峰的保留时间与质荷比数据；然后，通过峰对齐将各样品的数据汇总在单个矩阵中，并标记各变量的相对强度。处理过程的参数如下：质量窗口20 mDa，保留时间窗口0.30 min，强度阈值50 000 counts，5%峰高的峰宽1.00 s，除燥程度6.00。将处理好的数据导出为Excel格式，接着导入SIMCA-P 10.0做主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 甘油三酯的识别

由于天然油脂中的甘油三酯成分过于复杂，采用标准品定性既不实际也不经济。因此，本实验对甘油三酯的定性分析主要依靠Q-TOF-MS提供的精确质量数与丰富的碎片信息。在MSE采集模式中，根据低能模式下给出的前体离子[M+NH4]+的精确质量数推断其分子式，再通过高能模式下给出的碎片离子[M+H-FA]+识别甘油骨架上所结合的3个脂肪酸。TAG根据脂肪酸的简写而命名，按照脂肪酸分子在sn-1、sn-2、sn-3的顺序进行排列。但由于非手性方法无法区分sn-1和sn-3的对映异构体，所以将它们视为相同，并以分子质量减小的顺序排列。例如，酯化了1个棕榈酸(P)和2个油酸(O)，且1个油酸位于sn-2位的甘油三酯，该化合物被称为O-O-P，而不是P-O-O。

图1 S-P-O甘油三酯的低能质谱图(a)和高能质谱图(b)Fig.1 Mass spectrogram of S-P-O under low collision energy (a) and high collision energy (b)

据文献报道[9-10]，sn-1、sn-3位的酰基链比sn-2位的更易断裂，从而产生不同强度的碎片离子，这有助于确定位于sn-2位的酰基类型。保留时间为13.17 min色谱峰的低能和高能质谱图示于图1。由低能图(图1a)可知，准分子离子[M+NH4]+的质荷比为878.817 9，对应的TAG分子式为C55H104O6，误差为0.23×10-6；由高能图(图1b)可知，3个碎片离子分别为m/z605.551 0、579.534 9、577.518 4，对应于[S-O]+、[S-P]+和[O-P]+，其相对丰度分别为90.03%、100%和64.12%。由较低强度的[S-O]+可知，棕榈酸(P)占据了sn-2位，所以可认为该甘油三酯是S-P-O。该方法还可用于识别其他乳品色谱峰的TAG组成，其结果列于表1。可见，各物质的质荷比误差基本在5×10-6以下，定性的准确度较高。同时，该方法还可以在较短的时间内，部分分离一些同分异构体对，本实验共有13对同分异构TAG被分离，其中大部分得到了准确的识别。如根据碎片离子可以区分P-M-Co(9.62 min)和P-P-Bu(9.74 min)，其质谱图示于图2。需要说明的是，与二维液相色谱-质谱法相比，在本实验中部分甘油三酯不能达到基线分离，然而该方法能够在较短的时间内达到较为满意的分离度，对于快速、高通量的分析而言具有较大优势。

由于使用极性柱的超临界流体色谱分离机理类似于正相色谱，所以甘油二酯(Diacylglycerol, DAG)在甘油三酯之后流出，其识别与甘油三酯类似。首先，由准分子离子[M+Na]+的精确质量数计算出DAG分子式，由碎片离子[M+H-FA]+识别甘油骨架上2个相关的脂肪酸。例如，某色谱峰的准分子离子[M+Na]+m/z619.523 8对应的分子式为C37H72O5。两个碎片离子分别为m/z339.288 7和313.272 4，计算得出该DAG分子是1,3-SP或1,2-SP。本实验识别的所有DAG列于表2。由于该方法并不能得到DAG酰基的位置，所以在后续研究中有必要对其进行进一步确认。

2.2 不同哺乳动物乳汁中的甘油三酯组成

牛奶、羊奶中甘油三酯成分的基峰色谱图分别示于图3、图4，对比可见，羊奶的成分较牛奶更为复杂。图中一些色谱峰虽然仅有1个准分子离子峰，但由于存在同分异构体导致碎片离子过多而无法判别其结构，因此，从两图中共鉴定出55种TAG。在已识别的TAG中，属于牛奶脂肪组分的有48种，酰基链总碳数在26～54范围之间，双键数从0～4个不等；属于羊奶脂肪组分的有53种，酰基链总碳数在22～54范围之间，双键数从0～5个不等。牛奶脂中TAG酰基链总碳数主要集中在34～42；而羊奶脂中TAG酰基链总碳数较均匀地分布于28～52，其短链甘油三酯和长链甘油三酯含量较牛奶脂更为显著，也是由于羊奶中长链甘油三酯(如O-P-L，O-S-O，O-O-O)明显多于牛奶，意味着羊奶中的不饱和脂肪酸(如油酸、亚油酸)含量更高。膳食中的不饱和脂肪酸有调节血糖、血脂等作用[11]，适当摄取有利于人体健康。人乳脂中也含有较高含量的不饱和脂肪酸(>50%)[12]，这说明羊奶较牛奶更适于作为婴幼儿配方奶粉的原料。

表1 牛奶与羊奶中的甘油三酯组成Table 1 TAG composition of cow milk and goat milk

续表1

注：ACN表示酰基链总碳数；DB表示双键数；MIX表示多种TAG

注：a.P-M-Co的低能质谱图；b.P-M-Co的高能质谱图；c.P-P-Bu的低能质谱图；d.P-P-Bu的高能质谱图图2 同分异构体P-M-Co和P-P-Bu的质谱图Fig.2 Mass spectrogram of isomers of P-M-Co and P-P-Bu

牛奶与羊奶中的主要TAG成分相似，饱和脂肪酸构成的TAG占较大比例，其次为单不饱和脂肪酸，仅有少量的多不饱和脂肪酸，这一点与文献[13]描述相符。同时，本实验在牛奶脂和羊奶脂中还发现了4个重要系列的TAG组分，可以很好地描述牛奶和羊奶的TAG组成。第一系列可表示为P(O)-X-Bu，即P与Bu或O与Bu占据了甘油分子的sn-1、sn-3位，sn-2位从Co至P变化。第二系列的跨度较第一系列更广，可表示为P-P-X，X为Bu到S中任一饱和脂肪酸，也包括单不饱和脂肪酸O。第三系列与第二系列类似，可表述为O-X-O，其中X为Bu到S中除Ln外的任一脂肪酸。第四系列可表述为O-P-X，X为Bu到S中除Ln外的任一脂肪酸。这些特征TAG系列表明，与食用油[14-15]和人乳脂[16]相比，牛奶与羊奶中均含有较高含量的短链脂肪酸Bu与Co，尤其是Bu倾向于占据甘油分子的外部位置(sn-1、sn-3位)，不饱和脂肪酸 O也倾向于占据外部位置，内部位置(sn-2位)一般由碳链长短不一的饱和脂肪酸所占据。

通过质谱数据共识别出16种DAG，牛奶成分仅有其中的12种，而羊奶成分占有全部，且羊奶中的DAG含量高于牛奶。

2.3 主成分分析

由于多维数据的复杂性，仅仅依靠简单的比较不能完全揭示样品组之间的差异。本实验应用主成分分析(Principal component analysis, PCA)法处理复杂的SFC-MS数据，以达到“降维”的目的。以各主要色谱峰的保留时间与强度为变量进行PCA分析，得到了第一、二主成分得分图与载荷图，示于图5。由PCA模型得分图可见，羊奶样品与牛奶样品较好地分布在两个区域，表明它们之间存在较明显的差异。

载荷图表示的是对得分图中区分有贡献的变量，距离原点越远说明该物质在决定样品区分中的作用越大。据此可知，区分羊奶样品的几个重要指标是O-P-O、O-P-C、O-P-L、O-S-O和P-Co-C，表明这些较长链的TAG是羊奶与牛奶的显著差异成分；区分牛奶样品的几个重要指标分别是P-P-Co、O-P-Co、O-M-Co、O-Bu-O及O-P-P，主要是O、P与短中链脂肪酸所构成的TAG。

表2 牛奶与羊奶中的甘油二酯组成Table 2 DAG composition of cow milk and goat milk

图3 牛奶中甘油三酯成分的基峰色谱图(a)及放大图(b～d)Fig.3 Base peak chromatogram (a) and enlargements chromatogram (b-d) of triacylglycerols in cow milk

图4 羊奶中甘油三酯成分的基峰色谱图(a)及放大图(b1～b3)Fig.4 Base peak chromatogram (a) and enlargements chromatogram (b1-b3) of triacylglycerols in goat milk

图5 主成分分析得分图(a)与载荷图(b)Fig.5 Score plot (a) and loading plot (b) of principal component analysis

3 结论

采用超临界流体色谱-四极杆飞行时间质谱法检测了牛奶与羊奶中甘油酯组成，在25 min内分离并识别了55种甘油三酯与16种甘油二酯。结合主成分分析法对复杂的多维数据集进行了分析，明显地区分了牛奶与羊奶样品，并找出了二者的主要差异物质。该方法简便快速，可全面分析牛奶脂与羊奶脂中的甘油酯组成，同时也可作为常规分析手段来研究其他基质，如人乳脂、食用油中的甘油酯成分等。

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Rapid Determination of Triacylglycerols in Cow Milk and Goat Milk Using Supercritical Fluid Chromatography-Quadruple Time-of-Flight Mass Spectrometry

TU An-qi, DU Zhen-xia

(AnalysisandTestingCenterofBeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China)

Triacylglycerol (TAG) is the main component in milk fat, which determines the quality of milk fat. TAG composition in milk is varied among different species, diet and lactation stages. In this work, method of supercritical fluid chromatography combined with quadruple time-of-flight mass spectrometry (SFC-Q-TOF-MS) was developed for determination of complex acylglycerols in cow milk and goat milk. Milk fat was extracted withn-hexane. The instrumental conditions was as follows: the stationary phase was BEH 2-EP column, the mixture of methanol/acetonitrile/formic acid (50∶50∶0.1,V/V/V) was chosen as the mobile phase additive, the flow rate was 1.0 m/L, the column temperature was 50 ℃, automatic back pressure regulator was 1.1×104kPa, the injection volume was 1 μL. The separation method was utilized to analyze commercial cow milk samples and goat milk samples. Further identification of TAG compounds was based on the exact mass information of quasi-molecular ions, and the fragment ions were provided by Q-TOF-MS. A total of 55 triacylglycerols (TAGs) and 16 diacylglycerols (DAGs) were separated and identified within 25 min, including some pairs of TAG isomers, such as P-M-Co and P-P-Bu, showing the fast and excellent separation of SFC. The SFC-MS data showed that there were four important TAG series existed in cow and goat milk fat, including P(O)-X-Bu, P-P-X, O-X-O and O-P-X, indicating the high amount of saturated fatty acid in cow and goat milk fat. Although there were similar main TAG series in cow milk and goat milk samples, the concentration of unsaturated fatty acid in goat milk was relatively higher than cow milk, showing that goat milk may be more suitable for manufacture infant formula. Furthermore, principal component analysis (PCA) was applied to process the multidimensional data in order to better differentiating cow milk and goat milk, and cow milk samples and goat milk samples were classified clearly in the score plot of PCA. Major differences were obtained, including some long chain TAGs and medium chain TAGs. The SFC-MS method is high-throughput and environment friendly, providing an alternative approach besides LC/MS and GC/MS for TAGs analysis in food or biological samples, and might has a prospective future in the lipidomics. Since pressure drop in SFC system is much smaller than liquid chromatography, which is beneficial for combining several columns in series, more attention might be concentrated on the development of 2-dimentional SFC system in the future in order to obtain a better separation.

supercritical fluid chromatography; quadruple time-of-flight mass spectrometry; triacylglycerol; principal component analysis; cow milk; goat milk

2016-03-28;

2016-05-17

涂安琪(1991—)，女(汉族)，湖南衡阳人，硕士研究生，分析化学专业。E-mail: anqitu@163.com

杜振霞(1968—)，女(汉族)，河北石家庄人，教授，从事液相色谱-质谱联用技术研究。E-mail: duzx@mail.buct.edu.cn

时间：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1538.016.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0217-10

10.7538/zpxb.youxian.2016.0045