热应激脂多糖谷氨酰胺诱导牛睾丸支持细胞HSP72时效表达

丛霞，曲明媚，王龙光，张东君，田文儒，李华涛

(1．青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109;2．山东省肥城市畜牧兽医局，山东肥城271600)

热应激脂多糖谷氨酰胺诱导牛睾丸支持细胞HSP72时效表达

丛霞1，曲明媚1，王龙光1，张东君2，田文儒1，李华涛1

(1．青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109;2．山东省肥城市畜牧兽医局，山东肥城271600)

为了探讨温和热应激、脂多糖(LPS)和谷氨酰胺(Gln)诱导牛睾丸支持细胞(bSCs)HSP72的时效表达规律，本试验将传至第3代bSCs分成热应激、LPS和Gln处理组，用CCK－8试剂盒检测细胞活性，用RT－PCR和Western－Blot方法分别检测处理后0、2、4、6、8、12、14h和16 h时细胞内HSP72 mRNA和蛋白表达。结果显示，3种方式均能诱导HSP72表达，且HSP72蛋白分别在热应激、Gln和LPS预处理后2、4h和12 h时表达量最高。结果表明，热应激或Gln均比LPS诱导牛睾丸支持细胞HSP72表达的时间早，提示可考虑用Gln减少由LPS诱导的细胞损伤。

牛睾丸支持细胞;HSP72时效表达;脂多糖;谷氨酰胺;热应激

牛睾丸支持细胞(bSCs)可为包括精原干细胞在内的各级生精细胞提供物理支架，对精子生成具有至关重要的作用。高温环境、内毒素、微生物、炎症反应及理化因素刺激都会使睾丸间质细胞损伤，从而影响生精细胞的发育和精子生成，导致雄性成年家畜繁殖力显著下降。HSPs对细胞炎症和热应激等造成的损伤中发挥着十分重要的作用。有研究表明，热应激［1］、脂多糖(LPS)［2］和谷氨酰胺(Gln)［3］均可以诱导HSP72的表达，保护细胞和器官存活，降低机体死亡率。但是，热应激、LPS和Gln诱导牛睾丸支持细胞HSP72时效表达情况还不清楚。如果能证明HSP72时效表达的时间差异，也许可以利用HSP72分子伴侣作用。本研究以热应激、LPS和Gln为诱导因素刺激bSCs，诱导其HSP72表达，以探讨HSP72的时效表达规律，为进一步研究HSP72抗热应激和炎症反应的调控机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1．1 材料和试剂原代培养的奶牛犊睾丸支持细胞;CCK－8细胞活力检测试剂盒(南京建成生物工程公司);Gln(BioBasic Inc);RNA提取试剂盒(原平皓);反转录试剂盒(TaKaRa公司);LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche);HSP70(sc－1060)和GAPDH(sc－48166)抗体，购自Santa Cruze;兔抗羊IgG HRP和羊抗兔IgG HRP二抗(Jackson ImmunoResearch);Western及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所);其他试剂均为化学分析纯试剂。

1．2 试验方法

1．2．1 热应激、LPS和Gln对细胞活力的影响通过检测细胞活力筛选热应激、LPS和Gln的作用条件。热应激组:以34℃为空白对照组，37℃、39℃和41℃热应激1 h后恢复4 h，立即检测为0 h时间点。Gln组:分别用浓度为0、0．5、1、2、4 mmol/L和8 mmol/L的Gln与细胞在34℃下培养12 h。LPS组:分别用浓度为0、0．1、1、10、50 μg/mL和100 μg/mL的LPS与细胞在34℃下培养12 h。以细胞生长抑制率小于或接近10%为标准筛选诱导条件。

1．2．2 qT－PCR法检测HSP72基因表达根据1．2．1筛选得到的条件，分别检测热应激、Gln和LPS处理0、2、4、6、8、10、12、14 h和16 h后细胞HSP72基因表达量(引物序列见表1)。采用2－ΔΔCt方法分析HSP72 mRNA表达量的相对变化。

表1 试验中使用的RT－PCR引物

1．2．3 Western－Blot检测HSP72蛋白提取各组细胞总蛋白，利用Western－Blot方法检测和Image J软件进行灰度分析。HSP72与GAPDH的灰度比值作为HSP72的表达量。

2 结果与分析

2．1 热应激、LPS和Gln对bSCS活力的影响根据CCK－8检测原理，吸光度值越高表示活细胞数越多，结合本试验结果(表2)，选择对细胞伤害程度较小的39℃温和热应激、浓度为2 mmol/L Gln和0．1 μg/mL的LPS为诱导条件。

表2 热应激/℃、LPS(μg/mL)和Gln(mmol/L)对细胞活力的影响

2．2 热应激对细胞HSP72基因和蛋白时效表达的影响热应激后6 h内，显著升高了细胞HSP72 mRNA和蛋白表达(P＜0．01)，并且二者均呈先高后低的趋势，其中在热应激后0 h，HSP72基因表达最高，热应激后2 h其蛋白表达量最高(图1)。

2．3 LPS对HSP72基因和蛋白时效表达的影响

LPS能诱导细胞HSP72基因和蛋白表达，并呈先高后低的趋势。LPS处理后，细胞HSP72 mRNA表达在8～10 h显著升高(P＜0．01)，而HSP72蛋白表达在处理后12 h表达最高(图2)。

2．4 Gln对HSP72基因和蛋白时效表达的影响

Gln能使细胞HSP72基因和蛋白表达显著升高，并呈先高后低的趋势(图3)。其中，Gln处理后2～6 h，细胞HSP72 mRNA表达最高，而细胞HSP72蛋白表达则在Gln处理后4 h时表达量最高(P＜0．01)。

图1 热应激对HSP72基因和蛋白时效表达的影响

图2 LPS对HSP72基因和蛋白时效表达的影响

图3 Gln对HSP72基因和蛋白时效表达的影响

3 讨论

HSP72是热休克蛋白家族(HSPs)中研究最多、最受关注的一种，其在正常细胞［4］和胚胎［5］内以低水平表达，而在热应激情况下会迅速高表达。研究发现，大鼠肠黏膜HSP72蛋白表达水平随着热应激温度的升高而增加，且呈现一定的温度依赖效应［6］。本试验以不同温度热休克处理bSCs发现，在39℃处理时，细胞存活率最接近90%，并且在2 h内诱导bSCs高表达HSP72。

大量医学报道发现，HSP70表达和炎症反应关系密切，HSP70表达增加后有明显的抗炎症作用。研究还表明，细胞内HSP72能降低LPS诱导的促炎细胞因子和炎性介质合成与释放［7］。LPS又可降低细胞存活率或抑制细胞增殖，低浓度的LPS还能够诱导HSP72的表达［4］。而与热应激或Gln诱导HSP72表达不同的是，LPS诱导HSP72基因和蛋白表达的高峰分别出现在处理后的6 h和8 h，而LPS在6 h以前就已经能诱导细胞炎症因子表达并使其出现炎症反应［4］。这些结果说明，细胞受LPS刺激后先发生炎性反应，后引起HSP72表达，这就延缓了炎症反应中HSP72的抗炎作用。

有研究表明，Gln可以诱导HSP70的表达［8］，可作为诱导多种细胞HSP70表达的诱导剂。早在果绳Kc细胞上试验就发现，在Gln作用下，细胞才能最大量的表达HSP。在热应激条件下，Gln能使果绳Kc细胞HSP表达量提高100倍。并且，Aln－Gln具有减轻全身炎症反应的功能［9］。本试验中，Gln诱导HSP72基因和蛋白表达的时间均早于LPS处理的细胞。因此，可以推测，用Gln预处理细胞可增加其抗炎作用。当然，Gln通过增加HSP72抗炎的机制还不清楚，以及其对机体组织是否具有和体外培养细胞一样的作用效果等，都需要进一步深入研究加以验证。

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HSP72 aging expression induced by pretreatments with heat stress，LPS and Gln in bovine testicular sertoli cells

CONG Xia1，QU Ming-mei1，WANG Long-guang1，ZHANG Dong-jun2，TIAN Wen-ru1，LI Hua-tao1
(1．College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China; 2 Veterinary and Animal Husbandry Department，Feicheng 271600，China．)

This study was aimed to investigate HSP72 aging expression pattern of bovine Sertoli cell(bSCs)induced by pretreatments with mild heat stress，LPS and Gln．The bSCs on their third generation were used and divided into heat stress，LPS and Gln stimulating groups．The cell viability was detected by CCK－8．The cellular HSP72 mRNA and its protein expression levels were detected at 0，2，4，6，8，10，12，14 and 16 h after treatments by RT－PCR and Western－Blot，respectively，The results showed that three measures of pretreatment could all induce HSP72 expression，and the highest protein expression levels were appeared at 2，4 and 12 h after heat stress，Gln and LPS pretreatment，respectively．From the above results we concluded that heat stress and Gln prestimulation can induce HSP72 expression in advance in bovine Sertoli cells，which indicate that Gln may be used for ameliorates LPS induced cellular injury．

bovine Sertoli cells;aging expression of HSP72;lipopolysaccharide;glutamine;heat stress

LI Hua-tao

S853．72

A

0529-6005(2017)01-0020-03

2016－05－26

国家自然科学基金(31572590;31502138);山东省自然科学基金(BS2015NY001);山东省高等学校科技计划项目(J15LF03)

丛霞(1962-)，女，高级实验师，本科，从事兽医临床工作，E-mail:wrtian@126．com

李华涛，E-mail:htli1986@hotmail.com