6味中药提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用

(西南大学动物医学系，重庆荣昌402460)

6味中药提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用

冯韬，何玉张，李志强，喻祥，陈红伟

(西南大学动物医学系，重庆荣昌402460)

采用96孔板，分别对细菌单独培养和细菌与中药提取物共同培养，通过酶标仪测定其OD值来考察中药提取物对生物膜形成的影响。结果发现，苦参、柴胡、大青叶、白头翁、板蓝根、蒲公英6味中药的水提液和醇提液在高浓度下对金黄色葡萄球菌生物膜均有不同程度的抑制作用，其中白头翁醇提液、板蓝根醇提液、蒲公英醇提液在1倍MIC浓度下对细菌生物膜(BF)的抑制率均高于80%。

细菌生物膜;中草药;金黄色葡萄球菌;OD值

细菌生物膜(bacterial biofilm，BF)是细菌为适应环境、维持自身生命而产生的形态变化，从而使得细菌能够更好地适应外界环境的变化，许多难治性、顽固性的感染性疾病均与BF有关［1］。20世纪70年代末，生物膜理论正式形成，该理论认为大多数细菌都能形成BF，且生长在生物膜中［2］。据估计，大约65%细菌性感染是由生物膜细菌引起的［3］。因此如何抑制生物膜形成引起了学者们的广泛关注。

金黄色葡萄球菌是各类感染常见的致病菌，易吸附于生物材料表面生长并形成生物膜，常规剂量的抗生素和化学消毒剂作用无效，需加大药物剂量和延长用药时间，但伴随而来的是耐药菌株的产生，致使感染继而造成迁延不愈［4］。

目前研究表明，中药在抗生物膜方面具有独特的优势，文献报道应继续加强抗生物膜中药或有效成分的筛选，从单味药或复方中进一步筛选出具有抗生物膜功效的有效部位或提取特异性抗生物膜成分，探讨其对生物膜形成关键节点的影响，有望发现中药抗生物膜治疗的靶点［5］。本文以苦参等6味清热解毒中草药为原料，研究其提取物对BF的抑制作用，旨在为中药的抗生物膜研究用提供一些理论依据。

1 材料与方法

1．1 主要药品与试剂苦参、柴胡、大青叶、白头翁、板蓝根、蒲公英(购自重庆市荣昌区石家药房，并经实验室显微鉴定);结晶紫(批号:20111125，成都市科龙化工试剂厂);脱氧胆酸钠(批号:20101008，重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂)等。

1．2 试验菌株CVCC1882金黄色葡萄球菌标准菌株，由西南大学荣昌校区兽医科学实验中心提供。

1．3 主要仪器与设备Costar3599 96孔细菌培养板(上海凌初环保仪器有限公司);iMarK酶标仪(成都百乐科技有限公司);FA2204C电子天平(上海越华科学仪器有限公司)等。

1．4 方法

1．4．1 中药提取物的制备取白头翁，板蓝根，蒲公英、苦参、大青叶、柴胡粗粉100 g，分别加水煎煮3次，每次2 h，滤过，合并煎液，将滤液浓缩至100 mL，得药材水提部分。取白头翁，板蓝根，蒲公英、苦参、大青叶、柴胡粗粉100 g，分别加70%乙醇加热回流提取5次，每次3 h，滤过，合并煎液，将滤液浓缩至100 mL，得药材醇提部分［6］。

1．4．2 测定提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值

采用96孔板微量稀释法，设立阴性和阳性对照孔，依次加入各种中药提取液和菌液再将96孔板置于37℃恒温培养24 h观察结果，以没有出现浑浊的最小药物浓度为最低抑菌浓度。

1．4．3 金黄色葡萄球菌BF模型的建立取出冷冻保存的菌种，待其解冻后挑取若干接种于灭菌营养肉汤培养基中，在37℃的生化培养箱中培养过夜使其复活。次日再将复活后的金黄色葡萄球菌用划线分离培养法接种于营养琼脂平板，置于37℃培养过夜，第3天再挑选营养琼脂板上的单个菌落1～2个种入5 mL的营养肉汤中，置于37℃培养过夜，次日将该菌液用0．5号麦氏比浊管比浊，使其生长浊度达3×108CFU/mL，比浊好的菌液待用。

将备用菌液分别稀释0、10、50、100、200、300倍的不同浓度。在96孔板1～8列四周加培养基做空白，2至7列所加菌液分别为稀释了0、10、50、100、200、300倍的，做6个平行对照。将加好液的96孔板置于36℃恒温生化培养箱中培养24 h，取出，将菌液倾出，用蒸馏水反复清洗后，加入0．1%结晶紫染色30 min后，将结晶紫倾出，洗净，再加入1%脱氧胆酸钠溶液，30 min后，测其595 nm处的OD值。以菌液浓度为横坐标，OD值为纵坐标，考察金黄色葡萄球菌BF生长情况。

1．4．4 考察药物对金黄色葡萄球菌BF形成的影响在整个96孔板的四周加40 μL稀释的备用菌液和40 μL无菌水，中间的所有孔加入80 μL稀释好的菌液。第2行2～6孔加入同一种药液，用移液枪吹打混匀后吸取80 μL至第3行，以此类推到第7行，吸取80 μL弃去。2～11孔加入另一种药液，步骤如上。相当于每张板做2种药，每种药5个平行对照。然后将加好液的96孔板置于37℃恒温培养箱中24 h，取出，将菌液倾出，用蒸馏水反复清洗后，加入0．1%结晶紫染色30 min后，将结晶紫倾出，洗净，加入1%脱氧胆酸钠溶液30 min后，于595 nm处测其OD值，以药液浓度为横坐标，OD值为纵坐标，考察BF生长情况，同时做相同浓度乙醇液对照。

2 试验结果

2．1 各种中药提取物对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果见表1。

2．2 SBF模型建立的结果如图1所示。

图1表示，将菌液稀释了0、10、50、100、200、300倍进行培养，取6组数据平均值下的结果。由图1可知菌液稀释在不同的浓度下对金黄色葡萄球菌BF有一定的影响，当菌液浓度较高时，BF生长能力较弱;当菌液稀释100倍时，OD值为0.6± 0.02，BF生长好且趋于稳定，因此选定将菌液稀释100倍作为后续试验菌液浓度。

表1 各种中药提取物对金黄色葡萄球菌的MIC结果

图1 菌液稀释倍数对金黄色葡萄球菌BF的生长影响

2．3 以上述所测MIC值作为原始药液浓度，进行试验得出各种中药对金黄色葡萄球菌BF生长影响的结果(见表2)。

表2 中药提取物在不同浓度下对金黄色葡萄球菌BF的生长影响(OD值:珚X±SD;抑制率/%)

从表2可知，这6味药物提取物在高浓度下(MIC或1/2MIC)，OD值与对照组比较均显著性降低。其中，白头翁醇提液、板蓝根醇提液、蒲公英醇提液在1倍MIC浓度下对BF的抑制率均高于80%。而在低浓度下(1/16MIC或1/32MIC)，白头翁水提液、柴胡醇提液、大青叶水提液、大青叶醇提液的OD值反而呈现显著性升高。

3 分析与讨论

抗生素长期大量使用所产生的菌株耐药性问题愈来愈受到人们的重视，因此，寻找能够代替抗生素抑制生物膜生长的药物已成为时下学者们研究的热点。目前有关中药干预生物膜的研究很多，周强等［4］的研究发现，苦参与头孢他啶联用对铜绿假单胞菌生物膜有明显清除作用。姚禹等［7］研究了白头翁提取物对大肠杆菌生物膜的作用，发现白头翁醇提液与水提液均对大肠杆菌生物膜有较好的抑制作用，其中醇提液效果优于水提液。王翀［8］研究了柴胡皂苷D对白念珠菌和热带念珠菌生物膜的影响，发现柴胡皂苷D对两种念珠菌生物膜形成均有抑制作用。汪长中等［9］研究了10种中药水提物对白念珠菌生物膜的影响，发现适当浓度的蒲公英水提物和苦参水提物对白念珠菌的生物膜有明显抑制作用。另外，单味的中药黄莲、黄柏、黄芩、栀子、牡丹皮、金银花也有抑制或破坏细菌生物膜的作用［10－12］。

目前检测BF的方式主要有银染法、结晶紫染色法和扫描电镜观察法，后者可以清晰地观察到BF的结构，但使用价格较高且易受条件限制。银染法一般适用于对BF的定性观察，而结晶紫染色法常用于定量检测［10］。本试验旨在探讨中药提取物对BF形成的影响，根据实验原理和方法选择了结晶紫这种较为廉价的材料作为生物膜的染色剂。

本试验建立了可靠而稳定的金黄色葡萄球菌BF模型，并由此考察了苦参、大青叶、柴胡等中药提取物对金黄色葡萄球菌BF形成的影响。通过试验结果表明，6种中草药的水提液和醇提液对金黄色葡萄球菌BF形成均有不同程度的影响，高浓度提取物的抑制效果显著，白头翁醇提液、板蓝根醇提液、蒲公英醇提液在1倍MIC浓度下对BF的抑制率均高于80%。而在低浓度下(1/16MIC或1/ 32MIC)，白头翁水提液、柴胡醇提液、大青叶水提液、大青叶醇提液的OD值反而呈现显著性升高。提示部分中药提取物可能在低浓度会促进细菌生物膜的形成，具体机制还有待进一步研究。

［1］贾蓓蓓．金黄色葡萄球菌生物膜治疗抗茵药物研究进展［J］．中国现代医药杂志，2014，6(12):110-112．

［2］黄衍强，欧平，黄赞松，等．桂西地区幽门螺杆菌耐药性影响因素的分析［J］．重庆大学学报，2010，19:2555-2557．

［3］Xiaoqing Wang，Xiao Yaob，Zhen'an Zhu，et al．Effect of berberine on Staphylococcus epidermidis biofilm formation［J］．International Journal of Antimicrobial Agents，2009，34(1):60-66．

［4］周强，邓晨晖，张文，等．苦参提取物与头孢他啶联用对铜绿假单胞菌生物被膜清除作用影响的体外研究［J］．新中医，2008，40(12):98-99．

［5］孔晋亮，刘晓岚，陈一强，等．黄芩水煎液联合左氧氟沙星对铜绿假单胞菌生物被膜的影响［J］．天津医药，2008，36(5):331-333．

［6］王坤．细菌生物膜的形成和研究注射用双黄连对细菌生物膜的影响［D］．长春:长春中医药大学，2009:1-13．

［7］姚禹，包永睿，孟宪生，等．中药白头翁对体外大肠杆菌生物膜抑制作用研究［J］．基础医学，2013，24(3):20-22．

［8］王翀．柴胡皂苷D对白念珠菌和热带念珠菌生物膜的影响［D］．大连:大连医科大学，2012:1-37．

［9］汪长中，程惠娟，徐胜利，等．中药水提物对白念珠菌生物膜抑制作用的研究［J］．中国微生态学杂志，，2009，21(11):965-969．

［10］汪长中，程惠娟，徐颖，等．黄连解毒汤及其单味药对体外白念珠菌生物膜影响的比较［J］．上海中医药杂志，2008，42 (2):6365．

［11］汪长中，程惠娟，官妍，等．牡丹皮水煎剂对体外白念珠菌生物膜的抑制作用［J］．微牛物学杂志，2009，29(2):67-70．

［12］陈一强，覃雪军，朱莲娜，等．金银花水煎液及联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(9):738-742．

［13］李丽．牛源金黄色葡萄球菌生物膜相关基因分析及抗生素对其影响［D］．济南:山东师范大学，2011:15-18．

Inhibitory effect of extracts from sophora，radix bupleuri，folium isatidis，Pulsatilla chinensis，isatis root，dandelion on SBF

FENG Tao，HE Yu-zhang，LI Zhi-qiang，YU Xiang，CHEN Hong-wei
(Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Rongchang Campus，Chongqing 402460，China)

Bacteria were co-cultured with traditional Chinese medicine extracts in 96-well plates．OD values were determined by a microplate reader to examine the influence of traditional Chinese medicine extracts on biofilm formation．It was found the water extract and alcohol extract of sophora，radix bupleuri，folium isatidis，Pulsatilla chinensis，isatis root，dandelion at high concentrations had various inhibiting effects．The inhibition ratio of alcohol extract of Pulsatilla，isatis root，and dandelion at the concentration of 1 times of the MIC was higher than 80%．

bacterial biofilm;traditional Chinese medicine;staphylococcus aureus;OD

CHEN Hong-wei

S852．611

A

0529-6005(2017)01-0016-04

2016-03-18

中央高校基本科研业务费专项(SWU114026);中央高校基本科研业务费专项(XDJK2016B010);西南大学教育教学改革研究重点项目(2014JY096)

冯韬(1994-)，男，硕士生，从事兽医药理学研究，E-mail:15002358673@163．com

陈红伟，E-mail:chw80926@126．com