流行性造血器官坏死病病毒抗原捕获ELISA建立

刘宁，高志强，谷强，张旻，景宏丽，江育林，张利峰，刘金华

(1．中国农业大学动物医学院，北京海淀100193;2．北京市东城区动物卫生监督所，北京东城100027;3．北京出入境检验检疫局，北京朝阳100026; 4．中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京朝阳100029)

流行性造血器官坏死病病毒抗原捕获ELISA建立

刘宁1，2，高志强3，谷强3，张旻4，景宏丽4，江育林4，张利峰3，刘金华1

(1．中国农业大学动物医学院，北京海淀100193;2．北京市东城区动物卫生监督所，北京东城100027;3．北京出入境检验检疫局，北京朝阳100026; 4．中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京朝阳100029)

使用差速离心浓缩的病毒免疫山羊，获得高免血清并提取IgG，即为抗流行性造血器官坏死病病毒(EHNV)多克隆抗体。利用纯化的EHNV免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，经有限稀释法亚克隆，获得杂交瘤细胞株。将杂交瘤接种小鼠诱生腹水获得单抗3A4。以抗EHNV多克隆抗体为捕获抗体，单抗3A4为检测抗体，使用HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗，建立了EHNV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出103TCID50的病毒液上清和0.0056!g的MCP重组蛋白。对纯化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV病毒液进行检测，结果均为阴性，未发现交叉反应。本研究建立的EHNV抗原捕获ELISA方法，具有敏感、特异和重复性好的特点。通过应用于人工感染样品和临床样品的检测进一步证实了本检测方法的实用性。

流行性造血器官坏死病;抗原捕获ELISA

流行性造血器官坏死病是我国二类动物疫病，是世界动物卫生组织(OIE)规定必须申报的疫病。该病主要流行于欧洲和澳大利亚，由流行性造血器官坏死病毒(EHNV)引起的有鳍鱼类的系统性临床或亚临床感染，主要感染河鲈、虹鳟、欧鲇和鮰，能够引起这些鱼类出现内脏坏死乃至死亡［1－2］。

随着进出口贸易增多，EHNV传入风险增加［3］。尤其是EHNV对一般消毒剂具有一定耐受性［4］，可在环境中长期存在，且对此病毒的传播规律不完全掌握，这些因素增加了本病的防控难度［5］。迄今为止，国内有关本病抗原捕获ELISA检测方法的研究很少。研制用于EHNV检测的抗原捕获ELISA检测方法作为技术储备具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒EHNV，草鱼呼肠孤病病毒(GCRV)、流行性造血器官坏死病病毒(EHNV)、传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、本实验室保存。

1．2 主要试剂EHNV重组MCP，由本实验室保存。

1．3 主要仪器AB7900，AB公司;酶标仪，赛默飞公司。

1．4 动物BALB/c小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心。

1．5 EHNV病毒增殖与纯化将EHNV接种于单层的EPC细胞进行扩繁，用差速离心方法纯化和浓缩病毒。每200 mL病毒液浓缩到1 mL。

1．6 EHNV多克隆抗体的制备选择成年雄性山羊，用纯化的EHNV乳化好后作为抗原，使用FCA乳化的抗原颈部和背部皮下多点注射免疫山羊。前3次免疫间隔7 d，4～6次免疫间隔14 d，每次接种1 mL。第6次免疫接种后，收集血清。用饱和硫酸铵盐析方法粗提IgG。

1．7 EHNV单抗的制备按照常规方法用浓缩的EHNV抗原与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合，经多轮筛选和亚克隆获得阳性杂交瘤，将杂交瘤接种小鼠腹腔诱生腹水，获得单克隆抗体。

1．8 抗原捕获ELISA方法的建立本研究采用羊抗EHNV IgG作为捕获抗体，单抗3A4作为检测抗体。固定抗原量104TCID50/0.05mL。建立抗原捕获ELISA方法。

1．9 判定标准确定用建立的ELISA对经荧光PCR检测EHNV阴性的鱼脏器研磨液上清30份检测，将测定平均值+3×标准差作为临界值。

1.10 特异性阻断试验将104TCID50/0.05 mL病毒液50 μL和阴性对照分别与1∶2稀释后山羊抗EHNV阳性血清和1∶2稀释EHNV阴性山羊血清等量混合，4℃过夜，12 000 r/min离心30 min，取上清进行ELISA测定，根据阻断前后样品的OD值及P/ N值变化观察本方法的特异性。

1.11 灵敏度测定对105TCID50～10TCID50的病毒液，进行抗原捕获ELISA测定，确定检测极限，同时对105TCID50～100.1TCID50病毒液进行荧光PCR检测，比较灵敏度差异。此外，对5．6 μg/50 μL～0.00056 μg/50 μL的重组MCP抗原进行ELISA测定。

1.12 特异性试验对经差速离心纯化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV抗原应用建立的抗原捕获ELISA方法进行测定。

1.13 重复性试验测定方法的板内和板间重复性。

1.14 对人工感染虹鳟鱼脏器的检测结果对保存的EHNV感染虹鳟鱼的肝、脾、脑、肾和肠道组织10倍悬液应用建立的ELISA进行检测，并与荧光PCR方法进行比较。

1.15 EHNV对临床样品的检测结果用建立的方法对实验室收集的监测样品进行检测，这些监测样品包括脏器悬液280份，鱼卵98份，并与荧光PCR方法进行了比较。

2 结果

2.1 病毒增殖结果病毒接种EPC细胞24 h开始出现CPE，细胞出现固缩和聚集现象。96 h可见细胞固缩并大量聚集，拉网和折光性改变，大量细胞崩解，从细胞瓶上脱落(见后插彩版图1)。

2．2 羊抗EHNV IgG和腹水单抗ELISA效价的测定对制备的抗血清进行ELISA测定。羊抗EHNV IgG ELISA效价为1∶2×104。腹水单抗3A4的效价为1∶6.4×105。

2．3 抗原捕获ELISA方法的建立和优化用羊抗EHNV IgG作捕获抗体，单抗3A4作检测抗体建立了检测EHNV的抗原捕获ELISA方法。结果显示，IgG最佳的包被浓度为1∶800，检测单抗最佳稀释度为1∶6 000。酶标抗体最佳使用浓度为1∶2×104。

2．4 临界值确定结果显示，OD450nm平均值为0.214，标准差为0.053。临界值确定为0.4。

2．5 特异性阻断试验结果显示，阳性血清处理组，OD450nm值为0.334小于0.4，呈阴性;对照组的阳性抗原经阴性血清处理后，OD450nm值为0.986，仍为阳性结果，证明处理后阻断作用明显。

2．6 灵敏度测定结果显示，检测病毒液灵敏度为103TCID50/0.05 mL。检测重组蛋白抗原灵敏度为0.0056 μg，见表1。荧光PCR检测灵敏度为1 TCID50/0.05 mL(见后插彩版图2)，高于抗原捕获ELISA方法，与预期一致。

2．7 特异性试验结果显示，建立的方法与其他病毒抗原无交叉反应。

2．8 重复性试验结果显示，板内变异系数最大为4．30%。板间变异系数最大为9．87%。

2．9 人工感染样品的检测结果结果显示，肝、脾、脑、肾和肠道均能检出病毒抗原和核酸，且OD450nm值与Ct值呈负相关，即抗原捕获ELISA的P/N值越大，荧光PCR的Ct值越小。其中脾脏和肾脏含毒量最高，肝脏和肠道组织次之，脑组织含毒量较低(见后插彩版图3)。

表1 灵敏度测定结果

2.10 EHNV对临床样品的检测结果结果显示，378份临床样品经建立的抗原捕获ELISA和荧光PCR检测结果一致，均为阴性。

3 讨论

在10多年里，国内外学者建立了许多EHNV的实验室诊断技术，分为病毒检测与核酸检测两大类。病毒分离是诊断该病最为确切的方法，这种方法诊断本病需要很长的时间和繁重的人工，且不能保证成功分离到病毒。PCR技术是近年来建立起来的检测EHNV核酸的方法，但受人员技术、仪器、环境等限制，使PCR技术在基层推广困难。

ELISA具有特异、灵敏、重复性好、成本低廉、操作简单，适合大规模检测的优点，已成为水生动物渔场监测和流行病学调查最常用的方法，其中抗原捕获ELISA又是检测抗原最常用的方法。在抗原捕获ELISA中，如都采用单抗，即使是针对抗原上的两个不同位点，建立的方法灵敏度经常不理想，这也是限制用夹心法检测一些微量抗原的主要障碍。而用多抗捕获，单抗检测这一思路可解决这个问题，用多抗包被保证捕获的抗原比较充分，单抗的特异性可避免出现假阳性。

通过细胞培养来制备EHNV抗原对照的方法不仅费时、费力、成本高、易散毒而且获得的抗原常有被污染的可能，因此本研究选用重组MCP蛋白用于单抗筛选，并且可用作本方法的质控抗原，我们的试验也证实0.056 μg MCP重组蛋白与104TCID50/0.05 mL EHNV病毒液检测结果基本一致，可用于替代病毒液作为质控抗原。

本试验建立的方法在检测人工感染EHNV各种组织，结果与荧光PCR检测结果基本一致，且测定的P/N值与Ct值呈负相关，证实了方法的特异性和实用性。由于国内目前没有EHNV的发生，限制了阳性临床样品的采集，只能用人工感染样品作为替代阳性样品。进一步加大临床样品验证数量，推广建立的抗原捕获ELISA方法将是我们今后的重要工作。

［1］Langdon J S，Humphrey J D．Epizootic hematopoietic necrosis a new viral disease in redfin perch，Perca fluviatilis L in Australia［J］．Journal of Fish Diseases，1987，10(4):289-298．

［2］Langdon J S．Experimental transmission and pathogenicity of epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)in redfin perch，Perca fluviatilis L and 11 other teleosts［J］．Journal of Fish Diseases，1989，12(4):295-310．

［3］Reddacliff L A，Whittington R J．Pathology of epizootic haematopoietic necrosis virus infection in rainbow trout(oncorhynchus mykiss Walbaum)and redfin perch(Perca fluviatilis L)［J］．J Comp Pathol，1996，115(2):103-115．

［4］陈爱平，江育林，钱冬，等．流行性造血器官坏死病［J］．中国水产杂志，2010，12(12):57-58．

［5］黄辉三，李明玉，母伊楠，等．流行性造血器官坏死病毒(EHNV)PCR快速检测试剂盒的研制［J］．台湾海峡杂志，2011，30 (1):128-131．

Development and Application of Antigen Capture ELISA for the detection of Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus

LIU Ning1，2，GAO Zhi-qiang3，GU Qiang3，ZHANG Min4，JING Hong-li4，JIANG Yu-lin4，
ZHANG Li-feng3，LIU Jin-hua1
(1．College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China;2．Animal Health Inspection Institute of Dong Cheng District Beijing，Beijing 100027，China;3．Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China;4．Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029，China)

The hyperimmune antiserum against EHNV was obtained from goats which were repeatedly inoculated with purified EHNV virus by differential centrifugation．Then the anti-EHNV IgG，was prepared by the salting out method．Furthermore，the Balb/c mice were immunized with purified EHNV by intraperitoneal injection．When the valence of antibody was high enough，the spleen cells of mouse and myeloma cells were fused．Then the positive hybridoma cells were subcloned by limiting dilution．Finally the hybridoma cell line 3A4 that could stably secrete antibody against MCP protein of EHNV was obtained．A AC-ELISA for detection of EHNV was developed with goat anti-EHNV polyclonal antibody，3A4 and HRP-labeled anti-mouse IgG as coating antibody，detection antibody and conjugate respectively．The detection limit was 103TCID50 virus in supernatant or 0.0056mg recombinant MCP．The results were negative when the purified GCRV，IHNV，IPNV，VHSV and SVCV were detected with developed AC-ELISA．These results showed the AC-ELISA was sensitive，specific and repeatable．The applicability of AC-ELISA was confirmed by the detection of artificial infected samples and clinical samples．

Epizootic haematopoietic necrosis disease;Antigen capture ELISA

s:LIU Jin-hua;ZHANG Li-feng

S852．65

A

0529-6005(2017)01-0010-03

2016-03-25

十二五科技支撑课题“重大外来与新发水生动物疫病识别与监测技术研究及示范”(2013BAD12B02)

刘宁(1978-)，女，兽医师，硕士，主要从事动物检疫工作，E-mail:liuning1016@sina．com

刘金华，E-mail:ljh@cau．edu．cn;张利峰E-mail: zlf1973@163．com