丙烯酰胺对雌性Wistar大鼠学习记忆和长时程增强的影响及其可能机制

张 蔓，孟 涛，赵文锦，李 斌

（中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050）

丙烯酰胺对雌性Wistar大鼠学习记忆和长时程增强的影响及其可能机制

张 蔓，孟 涛，赵文锦，李 斌

（中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050）

目的研究重复sc给予丙烯酰胺（AM）28 d后对学习记忆的影响及其可能的作用机制，以及单次sc给予AM后对大鼠海马高频刺激后群峰电位（PS）幅度改变的影响。方法雌性Wistar大鼠分别sc给予AM 10，20和40 mg·kg-1（给药当天计为第1天），连续给予28 d。每周记录1次体质量。于第22～第27天进行Morris水迷宫实验，评价AM对大鼠空间定位能力的影响；分别于第29和第30天进行跳台实验，观察5 min内大鼠跳下平台的次数以及首次跳下平台的时间。取AM 40 mg·kg-1组大鼠海马组织，Western蛋白印迹法检测N-甲基-D-天冬氨酸受体（NR）2A及2B与Ⅱ型钙调蛋白激酶（CaMKⅡ）的表达与磷酸化水平。另取Wistar雌性大鼠，单次sc给予AM 40 mg·kg-1，进行长时程增强（LTP）实验，观察高频刺激后PS的改变。结果与正常对照组相比，给予AM后，大鼠体质量增长减缓（P＜0.01）。AM 20及40 mg·kg-1组大鼠找到平台的时间显著延长，但是对大鼠穿越平台的次数无显著影响。与实验首日（第29天）相比，经过电击强化学习记忆，正常对照组大鼠为躲避电击，次日（第30天）5 min内跳下平台的次数显著减少（P＜0.01），且首次跳下平台的时间明显延长（P＜0.01），而AM 10，20和40 mg·kg-1组5 min内的错误次数以及首次跳下平台的时间无显著改变。Western蛋白印迹结果显示，与正常对照组相比，AM 40 mg·kg-1组大鼠海马组织中NR2A及NR2B的表达与磷酸化水平显著增加，且CaMKⅡ磷酸化水平显著升高（P＜0.01）。LTP结果显示，与正常对照组相比，单次sc给予AM 40 mg·kg-1显著降低Wistar雌性大鼠海马的PS幅度（P＜0.01），损伤了大鼠海马部位的突触可塑性。结论AM可能通过改变谷氨酸的含量，增加NR的表达与活性，导致钙超载，引发神经细胞死亡，从而使LTP的PS幅度下降，影响海马神经突触的可塑性，最终影响中枢的学习记忆功能。

丙烯酰胺；跳台实验；Morris水迷宫；长时程增强

丙烯酰胺（acrylamide，AM）是一种水溶性不饱和酰胺，有着众多商业应用价值，广泛应用于化妆品、纸张、纺织品的生产过程，矿石开采，或作为土壤改良剂和絮凝剂应用于废水处理过程。AM水溶性强，可经皮肤黏膜、呼吸道及消化道吸收，在工作场所中，皮肤暴露是最常见的中毒途径。AM单体从20世纪50年代开始用于工业生产中，但很快发现其具有蓄积性神经毒性，主要伴随有共济失调、肌无力、认知损伤和（或）四肢麻痹等症状，学者们开始将其作为职业接触中毒物质进行研究［1］。研究表明，AM中毒患者的学习记忆能力发生障碍［2-3］，而学习和记忆属于大脑的高级活动之一，鉴于此，AM所致学习记忆的损伤尤其引起公共卫生领域的关注。1973年，Bliss等［4］在麻醉兔海马的穿通纤维与海马齿状回通路中首次观察并描述了长时程增强（long-term potentiation，LTP）现象，并在清醒兔上得到了同样的结果。学习记忆功能的障碍，会导致LTP的抑制，记录LTP是研究学习记忆的有效手段之一。迄今为止，多数研究者着重观察AM的神经毒性，而对海马LTP损伤及机制研究较少，尚无报道。课题组前期Zhang等［5］研究发现，雌性大鼠较雄性大鼠对AM的敏感性更高，为此后续课题组以雌性Wistar大鼠作为研究对象，建立AM神经毒性模型。另外，现有研究大多都采用ig或ip途径进行AM暴露染毒，为更好地模拟工人的实际暴露方式，本研究采用sc暴露方式观察AM对大鼠学习记忆能力以及LTP的影响，探讨AM影响学习记忆及LTP的可能机制，进一步阐述AM的神经毒性机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

AM（Amersco Lot#：0341），蒸馏水（屈臣氏）。用蒸馏水配制浓度为10，20及40 g·L-1的AM，经资料查询确定大鼠AM的经皮染毒的半数致死量（LD50）为400 mg·kg-1，以此为依据，分别取LD50的1/10，1/20和1/40做为染毒剂量。乌拉坦（Sigma-Aldrich，Lot#U2500），30%H2O2溶液（北京化工厂，Lot#A1029005）。一抗：兔抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NR）2A单抗（abcam，ab133265），兔抗NR2A（pY1325）多抗（abcam，ab106590），兔抗NR2B多抗（abcam，ab65783），兔抗 NR2B（pY1472）多抗（abcam，ab3856），兔抗Ⅱ型钙调蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）单抗（abcam，ab134041）以及兔抗CaMKⅡ（pT286）单抗（abcam，ab124880），兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多抗（abcam，ab9485）。二抗：山羊抗兔IgG H&L（abcam，ab175781）。跳台实验仪器与长时程增强记录仪由中国医学科学院北京协和医学院药物研究所王晓良老师提供，Morris水迷宫实验仪器（北京硕林苑科技有限公司），VideoMot2视频轨迹跟踪分析系统（德国TSE公司）。

1.2 动物和分组

健康8周龄雌性Wistar大鼠，清洁级，体质量180～220 g，共70只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，使用许可证号：SCXK（京）2012-0001，饲养于中国疾病预防控制中心实验动物室，许可证号：SXYK（京）2009-0032。动物饲养环境室温恒定（20～23℃），相对湿度40%～70%，通风良好，自由饮水，摄食。大鼠饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供，许可证号为SCXK（京）2009-0012。实验动物以及实验条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。将60只大鼠随机分为4组，分别为正常对照组，AM 10，20和40 mg·kg-1组。大鼠背部剃毛刀剪毛，暴露出一2 cm×2 cm的皮肤，在该处染毒，染毒体积为1 mL·kg-1，为统一染毒体积，AM 10， 20和40 mg·kg-1组分别给予浓度为0.14，0.28和0.56 mol·L-1的AM，正常对照组给予蒸馏水。如AM 20 mg·kg-1组体质量为200 g大鼠，用移液枪经背部皮肤给予200 μL，浓度为2.85 mol·L-1的AM溶液，并用枪头侧面涂抹至吸收。连续给予28 d，每周称量体质量，于染毒第22至第27天进行Morris水迷宫实验，并于染毒第29天和第30天进行跳台实验。实验结束后，从正常对照组及AM 40 mg·kg-1组随机选取5只大鼠，提取海马组织总蛋白，进行Western蛋白印迹分析。

1.3 Morris水迷宫实验

1.3.1 定位航行实验

从第22天开始本实验，每只大鼠每天训练2次（分别从两个非平台象限交叉点入池），每次1 min，连续训练5 d，记录大鼠找到平台的时间（逃避潜伏期），经60 s未找到平台者，将其引领至平台，放置30 s，引导其学习。每次潜伏期作为学习成绩，进行统计分析。

（7）加强抚育措施，提高园林植物抗逆性。由于绿化工作一般都是在基础建设完成后进行，质量良好的土壤在建设过程中被回填和运走，绿化的土壤是贫瘠土壤，并已被建筑垃圾污染，因此，在建筑设计时，必须将清除建筑污染规划进去。在建筑完成后，建筑垃圾由施工队清除运走，禁止将其埋在地下或堆在绿地上，同时禁止在绿地排放污水、垃圾等。在栽植前充分考虑土壤肥力，贫瘠土壤种植绿肥，提高土壤肥力后再用于绿化；选择树种时最大限度地满足适地适树的要求，可通过除草、灌水、施肥、修剪、控水、控肥、挂设鸟箱、引进有益的昆虫和微生物等措施，提高林木生长势，增加林木抗逆性。

1.3.2 空间探索实验

定位航行实验结束后（第27天），将平台撤去，大鼠于相同位置入池，自由游泳60 s，记录每只大鼠在60 s内穿越平台所在位置的次数作为衡量其空间学习记忆能力的指标。

1.4 跳台实验

实验装置为一40 cm×20 cm×30 cm的被动回避条件反射箱，用不透明黑色塑料分隔成两间，箱底有铜栅，间距为0.5 cm，可通30～36 V交流电。每一间左上角置一高4 cm，直径4 cm的橡皮圆台作为动物回避电击的安全区。参照文献［6］，实验开始前，先将大鼠放置在橡皮圆台上，适应周围环境3 min，然后通电，开始实验，记录大鼠首次跳下平台的时间（逃避潜伏期）以及5 min内跳下平台的次数（错误次数）。大鼠受到电击后，应跳上平台躲避电击，在实验首日，大多数动物可能再次跳下平台，在受到电击后又迅速返回平台。在24 h后，直接通电进行实验，再次记录潜伏期和错误次数。5 min内未跳下平台的，其潜伏期按5 min计。

1.5 Western蛋白印迹法检测LTP信号通路相关蛋白的表达

海马组织用生理盐水洗涤后加入约500 μL预冷的组织裂解液，冰浴中匀浆，冰上裂解30 min，于4℃12 834×g离心3 min，取上清，使用Bradford法进行定量，其余上清用来Western蛋白印迹检测。配制10%的分离胶以及5%的浓缩胶，取20 μg总蛋白进行电泳。转膜后，使用脱脂牛奶进行封闭。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，使用ECL发光试剂盒显色，并使用LAS3000 Image Reader进行读取并拍照，所得条带使用Quantity One软件进行分析，以目的蛋白与GAPDH内参蛋白的积分吸光度比值表示蛋白的表达量。

1.6 群峰电位（population spike，PS）幅度的测定

另取10只Wistar雌性大鼠随机分为2组，正常对照组以及AM 40 mg·kg-1组，单次sc染毒。大鼠ip给予乌拉坦（1.2 g·kg-1）麻醉后，将头部水平固定于脑立体定位仪上，暴露其颅骨，去除骨膜后用3% H2O2溶液涂抹颅骨表面使其骨缝清晰。以前囟点、矢状缝为基准，用9号不锈钢采血针头于刺激、记录电极、及参考电极上方分别钻孔备用。用立体定位仪确定前囟坐标，然后根据前囟坐标确定海马齿状回（dentate gyrus，DG，前囟后3.8 mm，中缝旁开2.0 mm）及同侧海马穿通纤维通路（perforant path，PP，前囟后7.5 mm，中缝旁开4.2 mm）坐标，将刺激电极下插到颅骨表面下3.0～3.5 mm，记录电极下插到颅骨表面下2.8～3.5 mm。银丝作为参比电极固定于颅骨或组织。以0.033 Hz频率记录基础PS至少30 min后，施加高频刺激（high-frequen⁃cy stimulation，HFS），具体参数为每串10个100 Hz的脉冲，共10串，串间隔300 ms。给予HFS刺激后，采用HFS前的记录条件记录PS波，发现可引起PS幅度的显著升高（大于HFS前30%以上），并可维持＞60 min即诱发LTP成功。

1.7 统计学分析

使用GraphPad Prism 6.01软件进行数据处理与统计分析，实验数据用表示。LTP实验结果用two-way ANOVA进行统计分析，跳台实验日间结果使用配对t检验进行统计分析，跳台实验日内结果及其他数据使用独立样本T检验进行统计分析；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AM对雌性Wistar大鼠在Morris水迷宫中找到平台时间的影响

在给予AM的第22～26天进行定位航行实验，从学习第2天起，随着学习次数的增加，大鼠找到平台所用时间（即潜伏期）逐渐缩短，这表明通过学习，大鼠可通过空间定位能力找到平台所在位置。在学习的前4天，正常对照组与AM组找到平台所用时间无显著差异，但在学习的第5天，正常对照组大鼠找到平台所用的时间明显缩短（P＜0.01），而AM组大鼠找到平台所花费的时间与学习前4 d相比无显著差异（图1）。AM 20和40 mg·kg-1组大鼠找到平台所用时间明显长于正常对照组大鼠（P＜0.05，P＜0.01），说明AM造成Wistar雌性大鼠在Morris水迷宫中的空间学习记忆能力损伤。

Fig.1Effect of acrylamide（AM）on escape latency of female Wistar rats in Morris water maze on 22nd-26thday.The rats were sc exposed to water or AM，5 d per week，4 weeks.n=12-15.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with nor⁃mal control group.

2.2 AM对雌性Wistar大鼠在Morris水迷宫中穿越平台所在区域次数的影响

在学习第6天（即染毒第27天）撤去象限内的平台，并观察大鼠穿越原平台所在区域的次数。AM 10，20及40 mg·kg-1组穿越平台所在区域的次数比少于正常对照组，但结果无统计学差异（表1）。

Tab.1 Effect of AM on crossing frequency of female Wistar rats in Morris water maze on 27thday

2.3 AM对雌性Wistar大鼠在跳台实验中首次跳下平台潜伏期的影响

由图2可见，实验首日，各组大鼠均频繁跳下平台，并在跳下后遭受电击重新返回安全平台，AM染毒组与正常对照组大鼠首次跳下平台的时间（即潜伏期）较短，但无统计学差异；大鼠5 min内跳下平台的次数也无统计学差异。在经过第1天的训练后，正常对照组大鼠学习并记忆了安全平台的存在。因此，实验次日，正常对照组大鼠首次跳下平台的潜伏期明显延长〔（34±17）svs（236±29）s〕，（P＜0.01）。但与正常对照组相比，AM 40 mg·kg-1组大鼠实验次日的潜伏期与实验首日相近，基本完全不能记忆实验首日的电击刺激，而AM 10和20 mg·kg-1组大鼠的潜伏期也延长（无统计学差异），也未能很好地记忆实验首日被电击的现实。

Fig.2 Effect of AM on escape latent period of female Wistar rats in step down test on 29th-30thday.See Fig.1 for the treatment.n=13-14.＊＊P＜0.01，compared with normal control group（1stday）by unpaired t test；##P＜0.01，compared with normal control group（2ndday）by independent t test.

2.4 AM对Wistar雌性大鼠5 min内跳下平台错误次数的影响

由图3可见，正常对照组大鼠实验次日跳下平台错误次数较实验首日明显减少（2.4±0.3vs0.4± 0.1）（P＜0.01），说明其具有正常的学习记忆能力。AM 10，20和40 mg·kg-1组大鼠实验次日的错误次数与实验首日相近。

Fig.3 Effect of AM on error times of female Wistar rats in step down test on 29-30thday.See Fig.1 for the treat⁃ment.n=13-14.＊＊P＜0.01，compared with normal control group（1stday）by unpaired t test；##P＜0.01，compared with nor⁃mal control group（2ndday）by independent t test.

Fig.4 Effect of AM on expressions and phosphorylations of N-methyl-D-aspartate receptor（NR）and calmon⁃dulin-dependent protein kinaseⅡ（CaMKⅡ）proteins in hippocampus of female Wistar rats.See Fig.1 for the treatment.B was the semi-quantitative result of A.n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 AM对雌性Wistar大鼠海马LTP信号通路相关蛋白的表达及磷酸化水平的影响

图4结果所示，与正常对照组相比，sc给予AM 40 mg·kg-128 d后，海马组织内的NR2A和NR2B的蛋白表达显著增加（P＜0.01），并且其磷酸化水平亦明显上调（P＜0.01），说明AM暴露可使大鼠海马的NR2A及NR2B蛋白的表达及活性增加。其蛋白表达水平的比值（NR2A/2B）以及磷酸化NR2A与NR2B（p-NR2A/2B）的比值，虽较正常对照组有上升趋势，但无显著性差异。此外，CaMKⅡ的磷酸化水平（p-CaMK）以及磷酸化与总蛋白水平（p-Ca/CaMK）也明显上调（P＜0.01），但其蛋白表达水平无显著改变。

2.6 AM对雌性Wistar大鼠海马齿状回PS的影响

如图5所示，HFS后，正常对照组PS幅度上升至（189±9）%，可成功诱发LTP；而AM 40 mg·kg-1组PS幅度仅上升至（149±5）%，显著低于正常对照组，（P＜0.01）。表明单次sc给予AM 40 mg·kg-1对HFS诱导海马PP-DG通路的LTP有抑制作用。

Fig.5 Effect of AM on population spike（PS）induced by high-frequency stimulation（HFS） in dentate gyrus of hippocampus in female Wistar rats.，n=3（in normal control group），and n=5（in AM 40 mg·kg-1group）.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 讨论

研究表明，AM亚慢性染毒后可引起大鼠运动功能和学习记忆能力的降低，主要表现为负重游泳时间缩短、水迷宫实验潜伏期延长以及游泳路程增加等［7］。Zheng等［8］研究表明，雄性Wistar大鼠ip给予AM 20及40 mg·kg-1，每周3次，连续给8周后，发现大鼠的学习记忆能力明显降低。另有研究表明，AM亚急性ig染毒可造成神经功能损伤及小脑结构病变［9］。与这些报道一致，本研究经sc暴露AM 40 mg·kg-1导致Wistar雌性大鼠在Morris水迷宫中潜伏期明显延长，以及跳台实验中错误次数显著增加，提示AM可损伤大鼠的学习记忆能力。此外，课题组前期研究结果表明，AM可能是通过抑制突触素蛋白Ⅰ的表达，从而损伤大鼠突触的可塑性［10］，而海马LTP是学习与记忆有关的突触可塑性的重要实验模型，是海马对信息进行编码记忆的神经生物学基础。在体LTP实验结果表明，单次sc给予AM 40 mg·kg-1可显著抑制LTP的PS幅度，影响突触可塑性，从而影响学习记忆，这一结果与同期行为学结果相印证。

已知与LTP产生十分相关的离子通道NR，是被众多科研人员所认同的触发LTP的主要因子。本研究结果表明，AM使学习记忆能力受损，但sc给予AM 40 mg·kg-128 d后，不仅NR2A及NR2B的蛋白表达及磷酸化水平升高，CaMKⅡ的磷酸化水平也显著高于正常对照组。研究表明，正常情况下，兴奋性氨基酸谷氨酸的释放，可激活NR，而NR的激活可进一步引起钙离子内流，从而使CaMKⅡ活化，增加LTP的PS幅度，有助于学习记忆［11］。然而，谷氨酸持续大量释放或含量明显降低，均可直接或代偿性地激活NR，进而触发CaMKⅡ的持续和过度活化，引发钙超载，导致神经细胞的线粒体肿胀，并发生细胞凋亡，从而抑制LTP，使学习记忆能力下降［12-13］。尽管本研究未直接检测AM暴露后海马区谷氨酸的含量，但课题组前期结果表明，ip给予AM 30 mg·kg-1染毒21 d和AM 50 mg·kg-1染毒11 d后，可显著降低大鼠大脑皮质及小脑内谷氨酸的含量［14］，另有报道称，亚急性ig暴露AM 15和30 mg·kg-1显著降低大鼠大脑皮质和小脑匀浆内谷氨酸的含量［7］。并且体外实验也表明，AM可浓度依赖性地降低谷氨酸的释放与摄取［15］。由此推断，本研究中AM导致的NR及CaMKⅡ的蛋白及磷酸化水平的显著增加，可能和谷氨酸水平改变有关。但AM导致脑内谷氨酸浓度的变化需要再次验证，其影响谷氨酸水平的分子机制仍需进一步研究。

综上所述，AM可能通过改变脑内谷氨酸的浓度，增加NR的表达与活性，同时持续活化CaMKⅡ，导致钙超载，致使LTP的PS幅度下降，最终导致学习记忆能力的损害。

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Effect and mechanism of acrylamide on learning and memory and long-term potential in female Wistar rats

ZHANG Man,MENG Tao,ZHAO Wen-jin,LI Bin

(National Institute of Occuptional Health and Poison Control,Chinese Center for Disease Prevention and Control,Beijing 100050,China)

OBJECTIVETo investigate the accumulated effect and the mechanism of repeated sc administration of acrylamide(AM)on learning and memory after 28 d,and the effect of AM on the amplitude of population spike(PS)potential after a single sc administration of AM.METHODSFemale Wistar rats were sc adminstered with AM 10,20 and 40 mg·kg-1once a day for 28 d,and weighted every week.The ability of study and memory was evaluated,The morris water maze was used from 22ndto 28thday,followed by step down test on the 29thand 30thday.The escape latent period and the number of errors in those two days were recorded.Rats from normal control group and AM 40 mg·kg-1group were taken to have theirN-methyl-D-aspartate receptor(NR)and calmodulin-dependent protein kinaseⅡ (CaMKⅡ)protein levels detected by Western blotting.Additionally,some other female Wistar rats were sc administered with a single dose of AM 40 mg·kg-1,before the changes in PS potential amplitude induced by high frequency stimulation were recorded by long-term potential(LTP).RESULTSCompared with normal control group,the relative body mass gain was significantly decreased in AM exposure groups(P＜0.01).Additionally,the escape latency period was significantly increased in AM 20 and 40 mg·kg-1groups compared with normal control group,while the crossing frequency was not significantly different betmeen these four groups.Compared with the first day of step down test,the number of errors was significantly decreased(P＜0.01)and the escape latency period was significantly extended(P＜0.01)in normal control group on the 2ndday.However,the number of errors and the escape latency period did not significantly change in the AM groups between the two days.The results of Western blotting showed that the protein expressions and phosphorylation of NR2A and NR2B,as well as the phosphorylation of CaMKⅡin AM 40 mg·kg-1group were significantly increased compared with normal control group.LTP result showed that AM 40 mg·kg-1significantly inhibited the amplitude of PS potential after a single percutaneous administration.CONCLUSIONAM can inhibit the PS amplitude by inhibiting the release of glutamate,increasing the expressions and activities of NR,and inhibiting PS potential, thus affecting the hippocampal synaptic plasticity,and the function of learning and memory.

acrylamide;step down test;Morris water maze;long-term potential

LI Bin,E-mail:binli6511@hotmail.com,Tel:(010)83132391

R114

A

1000-3002-（2017）01-0087-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.011

2016-07-07接受日期：2016-10-12）

（本文编辑：乔 虹）

国家自然科学基金项目（81273110）；中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所青年科技基金资助项目（2014YS03）

张 蔓，女，医学博士，助理研究员，主要从事化学品毒性及机制研究。

李 斌，E-mail：binli6511@hotmail.com，Tel：（010）83132391

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81273110);and Youth Science Foundation of National Institute of Occupational Health and Poison Control of China CDC(2014YS03)