粉托鬼笔固体培养特性的研究*

陈蒙蒙，程显好，封永继

（1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.鲁东大学农学院，山东 烟台 264025）

粉托鬼笔固体培养特性的研究*

陈蒙蒙1，程显好2**，封永继2

（1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.鲁东大学农学院，山东 烟台 264025）

为探讨粉托鬼笔（Phallus hadriani）在不同固体培养上的生长特性，采用固体培养基皿培法培养粉托鬼笔，研究不同固体培养基、不同碳源、不同氮源对粉托鬼笔的生长、菌丝形态、菌丝生长的影响。结果表明，粉托鬼笔菌丝体在不同固体培养基上均能生长，尤其是在麦麸固体培养基上生长最好。粉托鬼笔菌丝体对所试的不同碳源均能利用，而在以甘露糖、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、木聚糖为碳源的固体培养基培养时生长速度较快。在所试的不同氮源中，对有机氮源均能利用，而无机氮源中只对硫酸铵利用较好，在以亚硝酸钠和尿素为氮源的固体培养基上未见肉眼可辨的生长。

托粉鬼笔；固体培养；碳源；氮源；分子鉴定

粉托鬼笔 （Phallus hadriani） 隶属担子菌门（Basidiomycota）鬼笔目（Phallales）。鬼笔目作为一类食（药）用菌，红鬼笔和白鬼笔的子实体均已进行药理实验研究。红鬼笔具有散毒和生肌的作用[1]。白鬼笔被制成兴奋类药物，对癌症以及活血祛痛的治疗有一定作用[2-3]。粉托鬼笔作为1种具有潜在药用价值的食（药）用菌，开发前景广阔。

粉托鬼笔主要分布于我国山东、辽宁、吉林，在日本和欧洲也有分布[4]。粉托鬼笔由于分布稀少，野生采摘量较少，制约着对粉托鬼笔的药理研究，因此，急迫需要开展粉托鬼笔菌丝体及子实体的栽培研究。主要对不同固体培养基、不同碳源和不同氮源对菌丝体形态及生长特性的影响进行了研究，为粉托鬼笔的进一步研究奠定了基础。

1 实验材料和方法

1.1 菌种采集

本实验所用粉托鬼笔标本于2015年9月26日，采集于山东省蓬莱市大辛店镇沙沟村的花生田间，包括菌蕾和子实体。

1.2 试剂

淀粉、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、木糖、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇、木聚糖、半乳糖、鱼蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、硫酸镁、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、亚硝酸钠、尿素、琼脂。其中试剂类为国产分析纯或化学纯。

1.3 培养基

麦芽汁固体培养基：麦芽汁50 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然；胡萝卜固体培养基：胡萝卜（煮汁）200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然；PDA固体培养基：马铃薯（煮汁）200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然；麦麸固体培养基：麦麸（煮汁） 30 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO43 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然；GPY固体培养基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母浸粉10 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然；GPC固体培养基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨 6 g·L-1、玉米浆10 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然。

1.4 菌种分子鉴定与序列比对

参照Makimura等[5]的方法提取粉托鬼笔子实体样品（切除子实体表面，取内部组织）DNA和菌丝体DNA。按照刘等[6]的方法扩增ITS序列，采用真菌ITS通用引物 ITS1和ITS4，扩增ITS全长序列，得到的扩增产物送北京华大基因股份有限公司测序。

1.5 菌种分离

采用组织分离法分离菌种，将新鲜的子实体外面包被的胶质膜用大量的无菌水冲洗至表面无泥沙和其他杂物，然后用75%的酒精擦拭表面，在无菌条件下，将胶质膜切开，并将菌盖一剖为二，用已灭菌的尖头镊子从剖面上取0.5 cm×0.5 cm的菌肉组织，置于PDA培养基，25℃暗培养；选取培养良好的菌丝，转接到PDA培养基，反复纯化，选取生长健壮的菌丝转接到试管斜面PDA固体培养基，4℃低温保存。

1.6 培养方法

采用试管斜面培养和培养皿平板培养方式研究粉托鬼笔的固体培养特性。

将固体培养基分别倒入平板，凝固后铺上已灭菌的单层玻璃纸，接种直径6 mm的接种块，25℃、避光培养，定期观察菌落生长情况和菌落特征。

1.7 菌丝体生物量测定

将培养13 d的粉托鬼笔菌丝体从培养基表面的玻璃上刮下，每种培养基3个重复，称湿重，置60℃烘干箱烘干至恒重，再称干重即为生物量。

1.8 粉托鬼笔对碳源的利用试验

在GPY固体培养基的基础上，分别用2%的以下碳源代替2%的葡萄糖：果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、木糖、甘露糖、甘油、淀粉、甘露醇、木糖醇、山梨醇、木聚糖、半乳糖，制成的固体培养基平板接种粉托鬼笔菌丝之后，25℃条件下暗培养，定期观察粉托鬼笔在以上碳源条件下的生长情况。

1.9 粉托鬼笔对氮源的利用试验

在GPY固体培养基基础上，分别用以下0.6%的有机氮源代替0.6%蛋白胨：动物性氮源（鱼蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨）、植物性氮源（大豆蛋白胨）。用以下0.2%的无机氮源代替0.6%的蛋白胨：亚硝酸钠、硫酸铵、尿素。在各种不同氮源的培养基平板上接种粉托鬼笔之后，定期观察粉托鬼笔在以上氮源条件下的生长情况。

1.10 粉托鬼笔在不同培养基上生长速度的测定

从第4天开始每隔3 d记录菌落直径及其生长情况，到13 d时结束，每种处理3个重复。比较在不同培养基上的菌落扩散速度。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定与分子鉴定

子实体未成熟前为菌蕾（1.0 cm～6.5 cm），菌蕾成熟后变为粉红色，外层有1层胶质膜包裹，中间含有胶质液，最内层包裹着未成熟的子实体。子实体成熟之后，菌盖为圆锥形，网格状。菌柄为柱形，中空（4.0 cm～6.0 cm）×（0.6 cm～2.5 cm），质地像海绵，呈蜂窝状。采集标本经形态学鉴定为粉托鬼笔，见图1。

采用rDNA ITS序列方法进行分子鉴定。将扩增的DNA片段送至北京华大基因股份有限公司进行测序，并将测得序列在NCBI的Genbank数据库中进行Blastn同源性对比，根据Ident鉴定出该菌的种属，鉴定结果见表1。

经过测序，ITS序列的Ident为99%，确定该标本子实体和菌丝体均为粉托鬼笔。

图1 采集粉托鬼笔菌蕾及子实体标本Fig.1 Promordium and fruiting body of Phallus hadriani

表1 子实体与菌丝体在BLASTN序列对比结果Tab.1 Fruiting body and morphology in BLASTN sequencealignment results

2.2 粉托鬼笔在不同培养基上的生长情况

在不同的培养基中，粉托鬼笔的生长速度与生长形态不同。菌丝在固体培养基上的生长速度和生物量顺序均为麦麸培养基>胡萝卜培养基>PDA培养基>麦芽汁培养基>GPY培养基>GPC培养基，见表2。菌丝在不同固体培养基上表现出的形态特征见图2。

表2 粉托鬼笔在13 d时6种培养基上的生长特性Tab.2 Growth characteristics of Phallus hadriani on six medium in thirth day

从表2可以看出，在麦麸固体培养基中菌种扩散径向距离为7.75 cm，生物量达75.8 mg，为最适合培养粉托鬼笔的固体培养基。在麦芽汁培养基、胡萝卜培养基、PDA培养基上，气生菌丝体不发达，呈匍匐状紧贴在培养基表面；在麦麸培养基上，气生菌丝体发达，均匀向周围生长；在GPY培养基和GPC培养基上，气生菌丝体较发达，呈绒毛状。在培养的13 d内，粉托鬼笔气生菌丝的颜色均为雪白色。

2.3 碳源对粉托鬼笔生长的影响

不同碳源对粉托鬼笔菌丝体生长情况影响见表3。

粉托鬼笔在多种碳源中均能生长，说明其对碳源的的适应性较强。在不同碳源条件下，其生长速度和气生菌丝形态也有所差异。

粉托鬼笔在不同碳源的固体培养基上的生长速度依次为甘露糖>山梨醇>蔗糖>麦芽糖>木聚糖>果糖>半乳糖>乳糖>木糖>木糖醇>甘露醇>甘油>淀粉。在以果糖、半乳糖、乳糖、木糖醇、甘露醇、甘油为碳源的固体培养基中，虽然其菌丝体生长速度较慢，但是其气生菌丝生长致密、较发达。在以木聚糖为碳源的固体培养基中，其菌丝体生长速度较快，且其气生菌丝体也比较致密、发达。

2.4 氮源对粉托鬼笔生长的影响

不同氮源对粉托鬼笔的菌丝体的固体培养的生长特性见表4。

粉托鬼笔在多种有机氮源的固体培养基中均能生长。在动物性氮源（鱼蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨）培养基上菌丝体没有明显的差别，其生长速度较慢，气生菌丝致密、较发达。在植物性氮源（大豆蛋白）中，不仅其生长速度慢，而且气生菌丝比较稀疏、不发达。在无机氮源中，以亚硝酸钠、硫酸铵、尿素相比较，粉托鬼笔菌丝体在硫酸铵上生长速度较快，所以硫酸铵较适合粉托鬼笔菌丝体的固体培养；而在以亚硝酸钠和尿素为氮源的固体培养基上未见肉眼可辨的菌丝体生长。

2.5 粉托鬼笔菌丝体在固体培养基上菌落的生长特性粉托鬼笔菌丝体在不同培养上生长初期均能生长且菌丝颜色呈雪白色，但是随着培养时间的延长，其菌丝体逐渐老化，逐渐呈现淡粉色，菌丝体也逐渐失去水分。见图3。

3 讨论

粉托鬼笔菌丝体在不同的固体培养基上均能生长，对营养的要求并不苛刻，对碳源、氮源的适应性也较强，这也是其能在自然界长期生存繁衍的重要原因。

图3 粉托鬼笔菌丝体Fig.3 Mycelium of Phallus hadriani

在所有供试培养基中，粉托鬼笔菌丝体在麦麸固体培养基中生长速度最快，气生菌丝生长较致密、发达，为最适固体培养基。在所试碳源中，粉托鬼笔菌丝体均能生长，说明其对碳源适应较强，在以甘露糖为碳源的固体培养基上生长最好。在所试氮源中，粉托鬼笔菌丝体在有机氮源的固体培养基上均能生长，在无机氮源中只有在以硫酸铵为氮源的培养基中生长，在以亚硝酸钠和尿素为氮源的的固体培养基上未见肉眼可辨的菌丝生长。

粉托鬼笔作为一种潜在药用价值的药用菌，具有很大的开发前景。目前，由于粉托鬼笔的分布较少，野生采摘量比较少，对粉托鬼笔的药理研究比较困难，因此，对粉托鬼笔的子实体的栽培有待进一步的研究。

[1]宋吉玲，陆娜，闫静，等.红鬼笔、蛇头菌和五棱散尾鬼笔的区别与用途[J].杭州农业与科技，2015（5）：48.

[2]Niksic M,Hadzic I,Glisic M.Is Phallus impudicus a mycological giant[J].Mycologist,2004,18(1):21-22.

[3]李泰辉，宋斌，吴兴亮,等.滇黔桂鬼笔科研究[J].贵州科学,2004,22(1):80-89.

[4]王建瑞，图力古尔.吉林省担子菌补记（六）[J].菌物研究，2004（4）：40-43.

[5]Makimura K,Murayama YS,Yamaguchi H.Detection of a wide range of medically im portant fungal species by polymerase chain reaction(PCR)[J].Journal of Medical Microbiology,1994(40):358-364.

[6]刘贵巧，何华奇，王建明.一株野生食用菌株的种类鉴定研究[J].北方园艺，2014(12)：118-121.

Cultural Characteristics of Phallus hadriani Grown on Different Solid Media

CHEN Meng-meng1,CHENG Xian-hao2,FENG Yong-ji2
(1.College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China; 2.College of Agriculture,Ludong University,Yantai 264025,China)

To explore the cultural characteristics of Phallus hadriani on solid media,we used soild agar medium to culture P. hadriani.Effects of different soild media,carbon sources,and nitrogen sources on growth and morphology of P.hadriani were explored.Mycelial growth rate was most rapid on a medium containing an aqueous extract of malt(malt liquor).P.hadriani were grew better when mannose,sorbitol,sucrose,maltose and xylan was carbon sources in soild media.Organic nitrogen sources can be used by P.hadriani.P.hadriani were grew better when ammonium sulfate was nitrogen sources,but there were no growth when sodium nitrite and carbamide was nitrogen sources.

Phallus hadriani;solid culture;carbon source;nitrogen source;molecular identification

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0020-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.006

山东省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队（鲁农科技字 [2016]18号）。

陈蒙蒙（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向为生物资源保护与利用。E-mail:cmmmlyn@163.com

**通信作者：程显好（1966-），男，博士，教授，主要从事食（药）用真菌产品研发。E-mail:chengxianhao@sohu.com

2017-01-22