杏鲍菇与白灵菇红斑病病原菌拮抗菌的筛选与鉴定*

荣成博，胡 杰，杨永利，赵 爽，王守现，马 康，黄晨阳，刘 宇

（1.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京市食用菌工程技术研究中心，北京100097；

2.农业部都市农业（北方）重点实验室，北京100097；3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京100081）

杏鲍菇与白灵菇红斑病病原菌拮抗菌的筛选与鉴定*

荣成博1，2，胡 杰1，2，杨永利1，2，赵 爽1，2，王守现1，2，马 康1，2，黄晨阳3**，刘 宇1，2

（1.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京市食用菌工程技术研究中心，北京100097；

2.农业部都市农业（北方）重点实验室，北京100097；3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京100081）

筛选并鉴定杏鲍菇和白灵菇红斑病病原菌的拮抗菌，为该病的生物防治提供实验证据。通过牛津杯法筛选拮抗菌，并通过16s rDNA分析进行拮抗菌鉴定。结果表明，筛选到杏鲍菇红斑病病原菌的拮抗菌1株，为GL110，白灵菇红斑病病原菌的拮抗菌2株，分别为GL110和GL52。GL110鉴定为类芽孢杆菌属细菌，GL52鉴定为贪铜属细菌。

杏鲍菇；白灵菇；红斑病；拮抗菌

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）和白灵菇（Pleurotus nebrodensis）美味可口，营养丰富，并具有一定的药用价值，是我国的珍稀食用菌品种。随着杏鲍菇和白灵菇工厂化、周年化生产的迅猛发展，其病害逐年增多并加重，严重制约食用菌产业的持续、健康、稳定发展，近年来红斑病成为杏鲍菇和白灵菇栽培的新兴病害，目前并无防治手段。Xu等[1]2014年首次报道了北京房山工厂化车间的杏鲍菇红斑病，鉴定其病原菌为对称掷孢酵母（Sporobolomyces symmetricus）。Wang等[2]2015年首次报道了北京地区白灵菇红斑病，其病原菌为粘红酵母（Rhodotorula glutinis）。

近年来，生物防治在多种植物病害防治的过程中发挥了重要作用，该方法具有环境友好、无污染的优点。如土壤或者植物根际引入生防微生物能防治马铃薯黑痣病等多种土传病害[3]，利用拮抗菌来控制小麦赤霉病具有很好的防治效果。目前，在食用菌病害防治方面上并无任何生物防治的研究。本研究筛选并鉴定了杏鲍菇和白灵菇红斑病病原菌的拮抗菌，以其为红斑病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供试病原菌和供试拮抗菌由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所保存。

1.1.2 试剂

pMD19-T Vector购于Takara公司，PCR试剂（2×Taq PCR MasterMix） 购于北京艾德莱生物科技有限公司，蛋白胨、酵母粉购于Oxoid公司。氯化钠、磷酸二氢钾等其他试剂为分析纯，购于北京化工厂。

1.1.3 仪器与设备

HYG-A全温摇瓶柜，太仓市实验设备厂；YXQ-LS-30SLL立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；生物安全柜，Thermo公司。1.1.4 培养基

LB液体培养基：蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、氯化钠10 g·L-1，pH7.2～7.4。

综合PDB液体培养基：将去皮片状的马铃薯200 g在1 L水中煮沸30 min，16层纱布过滤，收集滤液并与葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、维生素B110 mg混匀后加水定容至1 L，锥形瓶分装后115℃灭菌30 min。

综合PDA培养基：PDB培养基中加入20 g·L-1琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的筛选

菌液的制备：将病原菌接种于20 mL综合PDB液体培养基中，28℃、200 r·min-1培养3 d；供试拮抗菌共40个，接于3mL LB液体培养基中，28℃、200 r·min-1摇床培养2 d。

拮抗菌的初筛：将病原菌菌液分别加到融化的综合PDA培养基（45℃～50℃）中混匀，接菌量为培养基的1%～2%；将混匀的培养基分别倒入平皿中；待培养基完全冷却后用打孔器在培养基边缘均匀打10个孔并编号，将培养好的拮抗菌菌液400 μL分别加入打好的孔中。将培养基置于25℃恒温培养箱中培养3 d观察透明圈。

拮抗菌的复筛：采用牛津杯法，将20 mL灭菌的培养基加热溶解倒入平皿中，待其完全冷却，在边缘中等距离均匀放置牛津杯；再加热溶解20 mL培养基，待其冷却至45℃～50℃，加入40 μL培养好的菌液混匀后倒入平皿。待培养基完全冷却，在牛津杯中分别加入待筛的拮抗菌，25℃恒温培养3 d～4 d观察。

1.2.2 拮抗菌的鉴定

取1 μL菌液做为模版，以16s8F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和16s1492R（5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’） 为引物进行PCR扩增。PCR产物进行切胶回收，连接到pMD19-TVector后转入大肠杆菌DH10B感受态细胞，经蓝白筛选后挑阳性克隆送北京中美泰和公司测序。将菌株16s基因序列与GenBank数据库中已知相关序列进行比对 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi），采用MEGA5构建系统发育树。采用Kimura2-parameter算法计算遗传距离，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，重复抽样1 000次分析系统数各分枝的信任度。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的筛选

GL52、GL110菌株对粘红酵母、对称掷孢酵母的抑制作用见图1。

图1 GL52、GL110菌株对粘红酵母、对称掷孢酵母的抑制作用Fig.1 The antagonism of strain GL52、GL110 against Rhodotorula glutinis and Sporobolomyces symmetricus

经过初筛和复筛的两轮筛选，产生透明圈的为能够抑制病原菌生长的拮抗菌，对白灵菇病原菌（粘红酵母） 有明显抑制作用的菌株为 GL52、GL110；能够明显抑制杏鲍菇病原菌-对称掷孢酵母的菌株为GL110。拮抗菌复筛结果见表1。

由表1可知GL52和GL110对粘红酵母的抑菌圈直径分别为32.30 mm和31.17 mm；GL110对对称掷孢酵母的抑菌圈直径为17.36 mm。

表1 拮抗菌复筛结果Tab.1 The results of antagonistic screening

2.2 拮抗菌株的鉴定结果

2.2.1 拮抗菌株GL110的鉴定

以16S rDNA序列为基础的GL110菌株系统发育树见图2。

PCR扩增GL110菌株的16S rDNA序列，连接到pMD19-T vector上并测序，将测序结果在NCBI网站上用BLAST程序进行比对，选取相似性较高的菌株，用MEGA5.0软件构建系统发育树。结果表明，该菌株与Paenibacillus属菌株的遗传关系最近。

图2 以16S rDNA序列为基础的GL110菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the strain GL110 based on 16S rDNA sequence

2.2.2 拮抗菌株GL52的鉴定

以16S rDNA序列为基础的GL52菌株系统发育树见图3。

参照1.2.2方法进行GL52菌株鉴定，图3结果表明GL52菌株与Cupriavidus属菌株遗传关系最近。

3 讨论和结论

红斑病是杏鲍菇和白灵菇栽培中的新兴病害，若不及时处理会形成更严重的污染和扩散，影响食用菌的产量，给企业造成巨大的损失。2014年Xu等[1]首次对该病进行了报道，目前并无该病的任何防治手段。拮抗菌为主的生物防治在植物病害防治方面研究较多，如解淀粉芽孢杆菌对小麦赤霉病的防治效果高达79%～88%[5]，放线菌FX-03对番茄早疫病的防治效果达到了75%以上[6]。

本研究首次对杏鲍菇和白灵菇的病原菌进行了拮抗菌筛选，共筛选到了2株抑制白灵菇病原菌生长的拮抗菌GL110和GL52，1株抑制杏鲍菇病原菌生长的拮抗菌GL110。对GL110和GL52分别进行了16SrDNA测序和系统发育树的构建，结果表明GL110与类芽孢杆菌属（Paenibacillus）同源关系最近，GL52与贪铜属（Cupriavidus）具有较高同源性。已有报道多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）和贪铜属（Cupriavidus） 具有抑制植物病原菌的活性[7-8]。

图3 以16S rDNA序列为基础的GL52菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the strain GL52 based on 16S rDNA sequence

[1]Xu F,Wang S,Liu Y,et al.First report of Sporobolomyces symmetricus induced red spot disease of Pleurotus eryngii in China[J].Plant Disease,2014,98 (5):693.

[2]Wang S,Rong C,Ma Y,et al.First report of Rhodotorula glutinis-induced red spot disease of Pleurotus nebrodensis in China[J].Journal of Plant Pathology,2015,97(1):218.

[3]关小敏，孟品品，刘星，等.马铃薯黑痣病生防菌的筛选和鉴定及其生长条件的研究[J].干旱地区农业研究，2015，33（3）：90-95.

[4]徐剑宏，王建伟，胡晓丹，等.小麦赤霉病菌拮抗菌的分离鉴定及其拮抗特性[J].江苏农业学报，2013，29（3）：517-522.

[5]蔺国强，廖玉才，宫安东，等.禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选与鉴定[J].华中农业大学学报，2013，32（3）：28-32.

[6]赵芳华，杨丽丽，沈志红.拮抗菌对番茄早疫病的防治效果[J].山西农业科学，2014，42（1）：60-65.

[7]邹芳芸，陈晓明，候军黄，等.烟草主要病原菌拮抗菌的筛选[J].食品工业科技，2015，36（9）：175-178.

[8]Köberl M,Ramadan EM,Adam M,et al.Bacillus and Streptomyces were selected as broad-spectrum antagonists against soilborne pathogens from aridareas in Egypt[J].FEMS Microbiol Lett,2013,342 (2):168-178.

Isolation and Identification of Antagonistic Strains Against Red spot Disease of Pleurotus eryngii and Pleurotus nebrodensis

RONG Cheng-bo1,2,HU Jie1,2,YANG Yong-li1,2,ZHAO Shuang1,2,WANG Shou-xian1,2, MA Kang1,2,HUANG Chen-yang3,LIU Yu1,2
(1.Institute of Plant and Environment Protection,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom,Beijing 100097,China;2.Key Laboratory of Urban Agriculture(North),Ministry of Agriculture,Beijing 100097,China;3.Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,CAAS,Beijing 100097,China)

Isolation and identification of antagonistic strains against red spot disease of Pleurotus eryngii and Pleurotus nebrodensis could provided the experimental evidence for biological control of the disease.The antagonistic strains against red spot disease of P.eryngii and P.nebrodensis were isolated and identified by oxford cup tests and the analysis on 16s rDNA.The results showed that a strain GL110 with inhibitory activity against P.eryngii pathogen,and the strains GL110 and GL52 displayed antagonistic activities against P.nebrodensis pathogen.GL110 and GL52 were identified as Cupriavidus respectively.

Pleurotus eryngii;Pleurotus nebrodensis;red spot disease;antagonistic strains

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0056-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.015

国家科技支撑计划课题食用菌生产质量安全控制关键技术研究 （2013BAD16B03）；北京市优秀人才培养资助计划（2015000020060G138）；北京市农林科学院青年基金项目 (QNJJ201524)。

荣成博（1981-），女，博士，助理研究员，主要从事食用菌病害和遗传研究。E-mail:woshiboer@163.com

**通信作者：黄晨阳（1977-），男，博士，副研究员，主要从事食用菌遗传育种和菌种质量检测工作。E-mail:huangchenyang@caas.cn

2017-01-12