高效液相色谱法测定水果中的灭螨醌和羟基灭螨醌*

曾铭，蒋小良，喻零春，苏淑坛

(1.花都出入境检验检疫局，广州 510800； 2.江门出入境检验检疫局，广东江门 529000)

高效液相色谱法测定水果中的灭螨醌和羟基灭螨醌*

曾铭1，蒋小良2，喻零春1，苏淑坛2

(1.花都出入境检验检疫局，广州 510800； 2.江门出入境检验检疫局，广东江门 529000)

建立了水果可农药灭螨醌和代谢产物羟基灭螨醌的高效液相色谱测定方法。样品经过正己烷-乙酸乙酯(体积比为1∶1)提取后，过石墨化碳氨基复合小柱净化，然后用高效液相色谱-荧光检测器法进行检测。结果表明，灭螨醌和羟基灭螨醌的质量浓度在0.01～5.0 mg／L范围内与色谱峰面积均呈现良好的线性关系，相关系数均为0.999 9。灭螨醌和羟基灭螨醌的检出限均为0.01 mg／kg。样品加标回收率为88.5%～102.3%，测定结果的相对标准偏差不大于于3.35%(n=5)。该方法灵敏度和准确度高，可满足水果可灭螨醌和羟基灭螨醌含量的测定要求。

灭螨醌；羟基灭螨醌；高效液相色谱；水果

灭螨醌是一种合成触杀性杀螨剂农药，是用来控制虱类、螨类和其它无脊椎动物的杀虫剂，它的代谢产物为羟基灭螨醌。灭螨醌无内吸活性，广泛用于梨、桃、柑橘、葡萄、黄瓜等防治螨类危害，具有高效、低毒、广谱和生物降解性等特性，在国际上得到广泛使用。按照我国农药毒性分级标准，灭螨醌属于低毒农药，对大鼠LD50为5 000 mg／kg［1］。欧盟、日本、加拿大及美国等国家地区对水果中灭螨醌残留量都有严格的限量标准，最大残留量(MRLs)为灭螨醌及其羟基灭螨醌的混合残留总量。欧盟［2］规定苹果和梨中灭螨醌MRLs为0.1 mg／kg，橙子为0.4 mg／kg；美国规定葡萄中灭螨醌的MRLs为1.6 mg／kg；日本“肯定列表”中梨和苹果中灭螨醌的MRLs分别为2 mg／kg和1 mg／kg。由于羟基灭螨醌仍然保留了与灭螨醌基本相同的萘醌结构，被同样认为对血液凝固会产生影响，因此对植物及动物性食品中的灭螨醌进行风险评估及残留检测时，除了灭螨醌，还应包括羟基灭螨醌［3］。

蔬菜水果中的农药残留是国内外研究热点［4-6］，检测方法主要有高效液相色谱法［7-8］、高效液相色谱-质谱法［9-10］及气相色谱-质谱法［11-13］。国外对灭螨醌检测的相关研究很少，主要集中在水果和蔬菜中的残留检测［14-15］，我国至今没有相关文献报道，也未曾制定国家标准和行业标准。笔者以正己烷-乙酸乙酯为溶剂，经萃取、浓缩、净化后，用高效液相色谱法定量测定水果中灭螨醌及羟基灭螨醌的残留量。本方法可促进我国水果中农药残留检测技术水平的提高，推动标准检测方法的建立。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1200型，带二极管阵列检测器，美国安捷伦科技有限公司；

紫外可见分光光度计：2450型，日本岛津公司；

高速组织捣碎机：BILONJJ-2型，江苏金坛市亿通电子有限公司；

旋转蒸发仪：R-210型，瑞士步琦公司；

氮吹仪：21011V001 R200型，瑞士步琦公司；

电子天平：TB215D型，美国丹佛公司；

超纯水系统：Synery UV型，美国Millipore公司；

灭螨醌：纯度不小于99.9%，德国Supelco公司；

羟基灭螨醌：纯度不小于99.9%，德国Supelco公司；

正己烷、乙酸乙酯：HPLC级，德国Merck 公司；

乙腈：HPLC级，美国Mallinckroat Baker公司；

SPE柱：Cleanert PestiCarb／NH2，500 mg／6 mL，博纳艾杰尔科技有限公司；

实验室用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm，10 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：25℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸(体积比为90∶10)，流量为1.0 mL／min，等度洗脱；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：250 nm；进样体积：20 μL；采用色谱峰的保留时间定性，峰面积外标法定量。

1.3 实验方法

切取水果样品中可食部分并捣碎，混匀，准确称取约10 g样品(精确至0.01 g)于100 mL离心管中，加入20 mL正己烷-乙酸乙酯混合液(体积比为1∶1，下同)，用高速组织捣碎机在12 000 r／min转速下均浆提取1 min，加入4 g无水硫酸钠，再均浆提取1 min，在4 000 r／min转速离心5 mim，取上清液10 mL(相对于样品5 g)加入50 mL梨形瓶中，在40℃水浴旋转浓缩至微干，加入2 mL正己烷-乙酸乙酯，超声30 s充分溶解。

加样前先用5 mL正己烷-乙酸乙酯混合液预淋洗SPE柱，然后从上述梨形瓶中取2 mL溶解好的果蔬样品提取液转移至净化柱中，再用3 mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗涤梨形瓶并转移入萃取柱，流量为2 mL／min，收集全部流出液，于水浴40℃下氮气吹干。用流动相溶解并定容至1 mL，经0.45 μm 滤膜过滤，滤液作为待测样液。按1.2色谱条件进行测定。

1.4 标准储备溶液的配制

分别精密称取灭螨醌和羟基灭螨醌各25 mg(精确至0.1 mg)，用正己烷溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，配制成灭螨醌和羟基灭螨醌含量均为1 000 mg／L标准储备液，置于4℃冰箱中储藏，待用。临用前各取1 mL灭螨醌和羟基灭螨醌标准储备液，用流动相定容到25 mL棕色容量瓶中，得到40 mg／L的灭螨醌和羟基灭螨醌混合标准溶液。使用时用流动相逐级稀释至所需浓度。

2 结果与讨论

2.1 灭螨醌和羟基灭螨醌的稳定性

根据加拿大卫生部的评估报告(ERC2007-10)，在pH 4的溶液中，灭螨醌74天后开始水解；pH 1.2时，灭螨醌19天后开始水解；pH 9时，灭螨醌76 min后发生水解。表明灭螨醌在弱酸性条件下相对稳定。同时，灭螨醌见光转化，在土壤中5.3天转化，在水溶液中则14 min开始转化。对灭螨醌及羟基灭螨醌标准工作溶液的稳定性做进一步研究，发现在避光条件下两者均较为稳定，所以实验过程中需要避光。

2.2 检测波长的确定

取灭螨醌和羟基灭螨醌标准混合溶液，用紫外分光光度计进行波长全扫描分析，扫描波长范围为200～400 nm，扫描结果见图1。由图1可知，灭螨醌和羟基灭螨醌在扫描波长范围内均有2个较大的吸收峰，其中最大吸收波长为250 nm，所以实验选择250 nm为检测波长。

图1 灭螨醌和羟基灭螨醌的紫外光谱图

2.3 流动相的选择

在等度洗脱条件下，试验考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈- 0.1%磷酸和甲醇- 0.1%磷酸作为流动相对灭螨醌和羟基灭螨醌的洗脱情况。试验结果表明，当流动相为乙腈- 0.1%磷酸溶液(体积比为90∶10)时，分离效果最佳，图2为混合标准溶液的色谱图。由图2可见，灭螨醌和羟基灭螨醌在20 min内可以实现很好的分离，且色谱峰形尖锐，有良好的对称性。

图2 灭螨醌和羟基灭螨醌混合标准溶液色谱图

2.4 线性方程、相关系数及检出限

分别移取适量灭螨醌和羟基灭螨醌标准储备溶液，用流动相逐级稀释，配制成含0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，5.0 mg／L灭螨醌和羟基灭螨醌混合标准溶液。在1.2色谱条件下，分别取样20μL进行分析，以标准溶液的色谱峰面积y对质量浓度c进行线性回归，以3倍信噪比计算检出限。灭螨醌和羟基灭螨醌的线性方程、相关系数和检出限见表1。由表1可知，灭螨醌和羟基灭螨醌的质量浓度在0.01～5.0 mg／L范围内与色谱峰面积均线性相关，相关系数均为0.999 9，两者的检出限均为0.01 mg／kg。

表1 线性方程、相关系数及检出限

2.5 精密度试验

称取苹果样品10.00 g，分别加入一定量的灭螨醌和羟基灭螨醌混合标准溶液，按1.3实验方法进行分析，每个浓度样品平行测定5次，测定结果见表2。由表2可知，灭螨醌和羟基灭螨醌测定结果的相对标准偏差为2.03%～3.35%，说明该方法具有良好的精密度。

表2 精密度试验结果

2.6 加标回收试验

称取苹果样品10.00 g，分别加入一定量的灭螨醌和羟基灭螨醌混合标准溶液，按1.3实验方法进行分析，结果见表3，加标样品色谱图见图3。从表3中数据可以看出，各组分的回收率在88.5%～102.3%之间，说明该方法具有较高的准确度。

表3 灭螨醌及羟基灭螨醌加标回收率测试结果

图3 加标样品色谱图

2.7 样品测定

按照1.3实验方法对水果市场采购的梨、苹果、香蕉等样品进行检测。结果表明，梨、苹果、香蕉等样品中均未检出灭螨醌及其代谢物羟基灭螨醌。

3 结语

建立了高效液相色谱-荧光检测器法检测水果中灭螨醌及其代谢物羟基灭螨醌含量的分析方法。灭螨醌及羟基灭螨醌的检出限均为0.01 mg／kg，加标回收率在88.5%～102.3%之间，相对标准偏差为2.03%～3.35%。该方法简便、快速，重现性好、准确度高，能够满足水果中灭螨醌及其代谢物羟基灭螨醌残留检测的要求。

［1］ Anonymous. Summary of toxicological studies on acequinocyl［J］. Journal of Pesticide Science，2001，26(4)： 433-438.

［2］ 王霓霓.主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限量标准［M］.北京：中国标准出版社，2010.

［3］ Acequinocyl Evaluation Report，Health Canada，19 November 2007［ R／OL］.［2007-11-19］. http：//www.hc-sc.gc.ca/cps-spc/ pubs/pest/_decisions/index-eng.php.

［4］ 吴成，任海雷，赵志强，等.液相色谱-串联质谱法测定甘蓝中的4-羟基百菌清的残留量［J］.化学分析计量，2016，25(6)： 71-74.

［5］ 李涛，赵云，利光辉，等.水果及果汁中苯并咪唑类农药残留检测技术研究进展［J］.粮食与食品加工，2016，23(1)： 80-83.

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［7］ 周震华，吴友谊，殷斌，等.基质固相分散-反相高效液相色谱法测定水果中的氨基甲酸酯农药残留［J］.分析试验室，2015，34(12)： 1 388-1 391.

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［9］ 林涛，汪禄祥，杨东顺，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜水果中的40种农药残留［J］.分析试验室，2014，33(10)：1 165-1 170.

［10］ 王炼，朱作芳，羊雨婷.同位素内标-液相色谱-串联质谱法测定水果中11种农药残留量［J］.中国食品卫生杂志，2016，28(2)： 209-214.

［11］ 李晓颖，张红医，常巧英，等.气相色谱-四级杆飞行时间质谱准确鉴定常见水果蔬菜中的农药残留［J］.色谱，2014，32(3)：268-277.

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国产食品安全检测设备发展空间大

目前，中国食品安全检测仪器市场规模超过百亿元，且增长速度有逐渐提高的趋势。虽然进口仪器抢占了国内市场先机，但国产仪器仍有巨大的发展空间。如何提高技术，将食品检测仪器做小做精、走进寻常百姓家是企业需要思考的问题。

随着科技的发展，影响食品安全的因素不断增多，需要检测的项目不断增加，其要求也越来越高，这对于检测技术和仪器、仪表都提出了更高的要求。在当前食品安全各项检测指标中，农药残留、兽药等参数的检测受到关注，所使用的检测仪器涉及质谱仪、色谱仪、分光光度计等高端检测仪器，在这些领域普遍以外资产品为主导。

目前国内一些较发达的城市农贸市场都建设了食品安全快速检测站，但仍未形成全国普及的局面。许多基层食品质检单位面临着检验设备不足、检测手段落后等问题。原因是目前进口检测仪器占据了我国主要市场。

外资企业实力雄厚，检测产品较为成熟稳定，但价格昂贵且维护维修费用高，这对于国内设备采购方来说负担较大，不利于国内机构检测水平的提升。要想彻底改变目前国内食品安全现状，提升检测仪器仪表企业的自主研发能力是解决问题的关键。

我国科学检测仪器产业起步较晚，在产业发展前期被国外知名品牌抢先占领市场，如美国安捷伦、赛默飞世尔科技、沃特世、日本岛津等企业早已入驻我国市场，对国内食品安全检测仪器市场形成巨大的冲击。而国内企业仍处于初级发展阶段，普遍存在规模小、人才分散、技术分散、资源分散等特点。由于缺乏核心技术，产品质量差、稳定性低，难以形成大规模产业化。

随着我国对食品安全监管力度的加大，各级政府对于仪器设备、科研经费的投入也在增加。2015年，国家食药监总局印发《关于加强食品药品检验检测体系建设的指导意见》，提出落实改革任务、强化硬件保障、加强人才队伍培养、完善制度体系、提升检验检测科研能力、推动检验检测信息共享6项重点任务。如果国产检测仪器能够形成技术突破，以其相对强大的性价比优势，能够满足市场对低成本设备的需求。

(可国分析计量网)

农业部制定千项农残标准 农产品追溯平台试运行

农业部通报，2016年全国农产品质量安全保持稳中向好态势，专项整治成效明显。今年农业部将加强农产品质量安全全程监管，新制定千项农残标准，农产品追溯平台试运行。

农业部数据显示，2016年全国主要农产品例行监测总体合格率为97.5%，同比上升0.4个百分点，全年没有发生重大农产品质量安全事件，农产品质量安全保持稳中向好态势。农业部副部长陈晓华举例，在专项整治方面，农业部门部署开展了禁限用农药、兽用抗菌药，生猪屠宰，农资打假等7个专项治理行动，切实解决面上存在的突出问题；加快农兽药残留标准制修订步伐，新制定农兽药残留限量标准1 310项、农业国家行业标准307项。

安全是老百姓对农产品对基本也是最持久的要求。陈晓华说，农产品质量安全首先是产出来的，生产方式要跟上，标准也要跟上。加强产地环境治理，集中力量解决土壤重金属污染等突出问题。推广清洁生产技术，推进化肥农药零增长行动，以果菜茶三大园艺作物为重点开展有机肥替代化肥试点。抓紧完善标准体系，标准不是越多越好，预估需要10 000项，到2020年左右，基本和国际接轨。

（ 央广网）

Determination of Acequinocyl and Hydroxyacequinocyl in Fruits by High Performance Liquid Chromatography

Zeng Ming1, Jiang Xiaoliang2, Yu Lingchun1, Su Shutan2
(1. Huadu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510800, China；2. Jiangmen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Jiangmen 529000, China)

An analytical method for determination of acequinocyl and hydroxyacequinocyl in fruits was established by high performance liquid chromatography (HPLC) method. Sample was treated with hexane and ethyl acetate solution (Volume ratio was 1∶1) extraction, and a Cleanert PestiCarb／NH2SPE column was used for the purification. Then quantitative analysis was conducted by HPLC-DAD. The results showed that the mass concentration of acequinocyl and hydroxyacequinocyl behaved linearly with the area of chromatographic peak in the range of 0.01-5.0 mg／L with the correlation coefficient of 0.999 9. The detection limit of acequinocyl and hydroxyacequinocyl was 0.01 mg／kg. The recovery varied from 88.5% to 102.3%, and the relative standard deviations of determination results were not more than 3.35%(n=5). The method is accurate and sensitive, and could satisfy the demand of the analysis of acequinocyl and hydroxyacequinocyl in fruits.

acequinocyl; hydroxyacequinocyl; high performance liquid chromatography; fruit

O657.7

:A

:1008-6145(2017)02-0044-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.02.012

*江门市科技计划项目(2016030100320007398)

联系人：蒋小良；E-mail： liang96@yeah.net

2017-01-12