高效液相色谱-质谱法分析僵蚕蛋白酶解多肽*

李灿，侯林，于瑞雪，张玉娟

(1.山东中医药大学药学院，济南 250355； 2.山东中医药大学附属医院，济南 250011； 3.山东中医药大学实验中心，济南 250355)

高效液相色谱-质谱法分析僵蚕蛋白酶解多肽*

李灿1，2，侯林1，于瑞雪3，张玉娟2

(1.山东中医药大学药学院，济南 250355； 2.山东中医药大学附属医院，济南 250011； 3.山东中医药大学实验中心，济南 250355)

分析僵蚕蛋白酶解多肽类成分的相对分子质量和氨基酸组成。采用高效液相色谱-质谱联用正离子模式进行分析，以Hola C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)为分离色谱柱，以0.05%甲酸水溶液和0.05%甲酸-乙腈溶液为流动相，根据质谱一级、二级碎片离子信息，确定酶解多肽类相对分子质量信息和氨基酸组成。僵蚕样品经酶解后得到相对分子质量在500～1 000之间的多肽，经LC-MS分析，多肽由低于10个的氨基酸组成。高效液相色谱-质谱法分析平台可用于分析多肽化合物的相对分子质量和氨基酸组成，这有利于酶解多肽的生物活性分析。

僵蚕；酶解多肽；氨基酸；相对分子质量

由多个氨基酸以肽键为桥梁相互连接而生成的化合物称为肽。一般而言，由低于10个氨基酸组成的肽叫做寡肽或低聚肽，超过10个氨基酸组成的肽称为多肽，50个以上氨基酸脱水生成的多肽为蛋白质。现代研究表明，作为药用动物的生物活性物质，蛋白质和多肽具有广阔的应用前景。近年来随着蛋白质组学的不断发展，研究学者发现，蛋白多肽是区别于蛋白质的一类具有特殊生理活性的物质，具有特异性强、生理活性高和生物功能明确等优势，涉及到信号识别、分子转导、细胞分化等生理功能［1-2］。赖仞［3］认为天然活性蛋白多肽既是解析生命现象必备的“分子探针与解密器”，也是发现与确立新药靶点的有力工具以及新药创制的优质先导分子。

僵蚕为蚕蛾科昆虫蚕幼虫期感染白僵菌而致死的干燥全虫，含有蛋白质、多肽、氨基酸、草酸铵、有机酸、香豆素、黄酮、多糖、挥发油、白僵菌素、核苷、酶类以及微量元素等成分［4-5］，具有抗惊厥、抗凝、抗肿瘤、抗氧化、镇静催眠、降血糖的作用［6-9］。作为僵蚕的主要活性物质，蛋白质、多肽、氨基酸具有抗凝作用［10-11］。近年来广大学者对其化学成分的研究已经取得阶段性成果［5-12］，但对僵蚕多肽组成的研究鲜见报道。反相高效液相色谱具有高分离度的特点，是分离纯化蛋白多肽类药物的有效方法之一，质谱具有研究物质组成和结构方面以及测序的优势，因此笔者采用高效液相色谱-质谱联用技术分析僵蚕中酶解多肽的氨基酸组成［13-15］。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱系统：UltiMate 3000型，配有SRD-3600型脱气机、HPG-3400SD型四元泵、WPS-3000TSL型自动进样器、ANAL YTICAL TCC-30000SD型柱温箱，美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；

高分辨率质谱：Q Exactive型，美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；

电子天平：01193-YP601N 型，上海精密科学仪器有限公司；

高速离心机：D-37520 Osterode型，美国Thermo Fisher公司；

数控超声波清洗器：KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司；

僵蚕：蛾科昆虫家蚕4～5龄的幼虫感染体白僵菌而致死的干燥体；

甲醇、乙腈：色谱纯；

实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Halo C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国Advanced Materials Technology公司)；流量：0.3 mL／min；进样体积：1 μL；柱温：45℃；进样室温度：4℃；流动相：A为0.05%甲酸-水溶液，B为0.05%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；采用正离子模式全扫描检测；鞘气流量：45 L／min；辅助气流量：10 L／min；辅助气耐热温度：30℃；喷雾电压：3.0 kV；毛细管温度：275℃；质谱分辨率：70 000 FWHM(m／z200)；扫描范围：m／z100～1 200；碰撞电压：900 V。

1.3 供试品溶液的制备

精密秤取僵蚕5 g，胃蛋白酶160 μg酶解，加水45 mL(以乙酸调节pH为1.5)，于42℃水浴2 h，再于85℃水浴灭活15 min，将灭活后提取液以3 000 r／min离心15 min，取上清液抽滤，滤液用纯水定容至50 mL，超滤后冷冻干燥，得到相对分子质量为500～1 000的样品。

精密称取上述样品2 mg，置于100 mL的容量瓶中，加20 mL超纯水超声(250 W，40 kHz)10 min，用一次性胶头滴管定容至标线，过0.22 μm滤膜于进样小瓶中，得待测样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 样品色谱图和质谱图

按1.2仪器工作条件测定样品溶液，得样品溶液的总离子流色谱图(见图1)及质谱图(见图2)。由图1中可以看出，样品中蛋白多肽类成分色谱峰主要分布在42～47 min。提取样品酶解多肽区段m／z500～1 000质谱图，对总离子流图中42.31 min(记为a分子)、44.62 min(记为b分子)、45.44 min(记为c分子)、46.27 min(记为d分子) 4个色谱峰进行氨基酸序列解析。

图1 样品总离子流色谱图

图2 样品总质谱图

2.2 氨基酸序列解析

样品在42.31 min(a分子)酶解肽的一级、二级质谱图如图3、图4所示。

图3 a分子一级质谱图

图4 a分子二级质谱图

一级质谱图中m／z1 155为［M+H］+离子峰，电荷数为1，说明a相对分子质量为1 154，氨基酸的平均相对分子质量为128，根据氮律a分子应含有偶数个氮原子，推断a为八肽化合物。m／z1 155离子失去一分子苏氨酸(119 Da)、一分子水(18 Da)和一分子羟基(17 Da)生成m／z1 001离子。m／z1 001离子失去一分子亮氨酸(131 Da)或异亮氨酸(131 Da)和一分子谷氨酸(147 Da)生成m／z741离子。m／z741离子生成m／z529离子有4种情况：(1)m／z741离子失去一分子甘氨酸(75 Da)和一分子组氨酸(147 Da)生成m／z529离子；(2)m／z741离子失去一分子脯氨酸(115 Da)和一分子天冬酰胺(115 Da)生成m／z529离子；(3)m／z741离子失去两分子脯氨酸(115 Da)生成m／z529离子；(4)m／z741离子失去两分子天冬酰胺(115 Da)生成m／z529离子。m／z529离子失去一分子亮氨酸(131 Da)或异亮氨酸(131 Da)和一分子色氨酸(204 Da)生成m／z212离子。最后生成m／z149离子为甲硫氨酸。

综上所述，a分子肽链有以下几种情况：(1)苏氨酸-［亮氨酸／异亮氨酸-谷氨酸］-［甘氨酸-组氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-色氨酸］-甲硫氨酸；(2)苏氨酸-［亮氨酸／异亮氨酸-谷氨酸］-［脯氨酸-天冬酰胺］-［亮氨酸／异亮氨酸-色氨酸］-甲硫氨酸；(3)苏氨酸-［亮氨酸／异亮氨酸-谷氨酸］-脯氨酸-脯氨酸-［亮氨酸／异亮氨酸-色氨酸］-甲硫氨酸；(4)苏氨酸-［亮氨酸／异亮氨酸-谷氨酸］-天冬酰胺-天冬酰胺-［亮氨酸／异亮氨酸-色氨酸］-甲硫氨酸。

样品在44.62 min(b分子)处的一级、二级质谱图如图5、图6所示。一级质谱图中m／z1 012［M+H］+离子峰，电荷数为1，说明b相对分子质量为1 011，氨基酸的平均相对分子质量为128，根据氮律b分子应含奇数个氮原子，推断b为七肽化合物。m／z1 012失去一分子甘氨酸(75 Da)，一分子亮氨酸或异亮氨酸(131 Da)和一分子色氨酸(204 Da)生成m／z638离子。m／z638离子失去一分子甘氨酸(75 Da)、一分子脯氨酸(115 Da)或天冬酰胺(115 Da)生成m／z466离子。m／z466离子失去一分子脯氨酸(115 Da)或天冬酰胺(115 Da)和一分子赖氨酸(182 Da)生成m／z187的离子。

图5 b分子一级质谱图

图6 b分子二级质谱图

综上所述，c分子肽链存为［甘氨酸-亮氨酸／异亮氨酸-色氨酸］-［甘氨酸-脯氨酸／天冬酰胺］-赖氨酸。

样品在45.44 min(c分子)处的一级、二级质谱图如图7、图8所示。一级质谱图中m／z969［ M+H］+离子峰电荷数为1，说明c分子的相对分子质量为968，氨基酸的平均相对分子质量为128，根据氮律c分子应含偶数个氮原子，推断c为八肽化合物。m／z969离子生成m／z648离子有两种情况：(1)m／z969离子失去一分子甘氨酸(75 Da)、一分子缬氨酸(117 Da)和一分子苯丙氨酸(165 Da)生成m／z648离子；(2)m／z969离子失去一分子甘氨酸(75 Da)、一分子天门冬氨酸(133 Da)和一分子甲硫氨酸(149 Da)生成m／z648离子。m／z648离子失去一分子亮氨酸(131 Da)或异亮氨酸(131 Da)和一分子天门冬氨酸(115 Da)或一分子脯氨酸(115 Da)生成m／z420离子。m／z420离子生成m／z168离子有4种情况：(1)m／z420离子失去一分子丙氨酸和一分子酪氨酸生成m／z168离子；(2)m／z420离子失去一分子甲硫氨酸和一分子半胱氨酸生成m／z168离子；(3)m／z420离子失去一分子脯氨酸或一分子天冬酰胺和一分子组氨酸生成m／z168离子；(4)m／z420离子失去一分子苯丙氨酸和一分子丝氨酸生成m／z168离子，最后生成的m／z147离子为谷氨酸(147 Da)。

图7 c分子一级质谱图

图8 c分子二级质谱图

综上所述，c分子肽链存在以下几种可能：(1)［甘氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［丙氨酸-酪氨酸］-谷氨酸；(2)［甘氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［甲硫氨酸-半胱氨酸］-谷氨酸；(3)［甘氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［天冬氨酸／脯氨酸-组氨酸］-谷氨酸；(4)［甘氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［苯丙氨酸-丝氨酸］-谷氨酸；(5)［甘氨酸-天门冬氨酸-甲硫氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［丙氨酸-酪氨酸］-谷氨酸；(6)［甘氨酸-天门冬氨酸-甲硫氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［甲硫氨酸-半胱氨酸］-谷氨酸；(7)［甘氨酸-天门冬氨酸-甲硫氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［天冬氨酸／脯氨酸-组氨酸］-谷氨酸；(8)［甘氨酸-天门冬氨酸-甲硫氨酸］-［亮氨酸／异亮氨酸-天冬氨酸／脯氨酸］-［苯丙氨酸-丝氨酸］-谷氨酸。

样品在46.27 min(d分子)处的质谱图如图9、图10所示。一级质谱图中m／z1 180［ M+H］+离子峰，电荷数为1，说明d的相对分子质量为1 179，氨基酸的平均相对分子质量为128，根据氮律d分子应含奇数个氮原子，推断d为九肽化合物。m／z1 180失去一分子半胱氨酸(121 Da)生成m／z1 059离子。m／z1 059失去一分子组氨酸(155 Da)和一分子天门冬氨酸(133 Da)生成m／z789离子。m／z789离子失去一分子酪氨酸(181 Da)生成m／z608离子。m／z608离子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子谷氨酸(147 Da)生成m／z390离子。m／z390离子生成m／z129离子有三种情况：(1)m／z390离子失去两分子甘氨酸(75 Da)和一分子谷氨酸(147 Da)生成m／z129离子；(2)m／z390离子失去一分子甘氨酸、一分子丙氨酸和一分子天门冬氨酸生成m／z129离子；(3)m／z390离子失去一分子甘氨酸(75 Da)、一分子缬氨酸(117 Da)和一分子丝氨酸(105 Da)生成m／z129离子。

图9 d分子一级质谱图

图10 d分子二级质谱图

综上所述，d分子肽链存在以下几种情况：(1)半胱氨酸-［组氨酸-天门冬氨酸］-酪氨酸-［丙氨酸-谷氨酸］-［甘氨酸-甘氨酸-谷氨酸］；(2)半胱氨酸-［组氨酸-天门冬氨酸］-酪氨酸-［丙氨酸-谷氨酸］-［甘氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸］；(3)半胱氨酸-［组氨酸-天门冬氨酸］-酪氨酸-［丙氨酸-谷氨酸］-［甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸］。

3 结语

对相对分子质量在500～1 000的多肽样品进行高效液相色谱-质谱分析，根据多肽样品的一级和二级质谱图，可对多肽样品的部分氨基酸序列进行排列而不能得到准确的氨基酸序列。笔者推测这与串联质谱的碰撞电压选择有关，碰撞电压的确定与碎片离子的数量密切相关，在本实验中碎片离子信息不完整，这对多肽样品氨基酸序列的确定带来困难。通过谱图解析发现，有部分无法鉴别的碎片离子峰，笔者推测这与多肽样品受体内体外环境因素的影响，氨基酸残基出现氧化、还原、水解、脱酰胺等作用从而稳定性降低有关。因此对僵蚕样品氨基酸序列的确定还需要进一步的研究。

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全国环境空气质量监测网建成

“十二五”以来，我国初步形成了满足大气环境常规监测需求的技术体系，发展了PM2.5、臭氧和挥发性有机物VOCs等在线监测技术。目前我国已经设置国家、省、市、县4个层级的5 000余个监测站点，环境空气质量监测网已经建成。

专家介绍，为了保障监测数据真实有效，监测数据在每个国控站点产生后，原始数据第一时间分别直传城市站、省级站以及中国环境监测总站平台，3个层面同时获得站点的监测数据。1 436个国控监测站都建立了远程质控系统，具备变化留痕、异常报警等功能。

中国环境监测总站大气室主任宫正宇介绍说，目前从全国6个层面来说，我国已建成一个庞大又复杂的环境空气质量监测网络，包括城市的以及区域空气的、背景空气的、酸雨的、沙尘暴，还有温室气体的监测。

(1)70余个超级站助力“精准治霾”。在庞大又复杂的监测网络中，组分网不仅可以测量PM2.5浓度，还能测算污染物中到底有哪些成分，有助于重污染成因的分析，为“精准治霾”提供数据支持。目前已经建成超级站点70多个。

为了加强京津冀及周边区域重污染天气的应对，开展大气污染成因分析和应急措施效果的评估，目前建立的组分网覆盖了北京、天津、石家庄、郑州、济南等20个城市。中国环境监测总站分析室副主任吕怡兵表示，对于监测点位的布设，它主要考虑各个城市典型区域环境质量的状况，特别是关注污染传输通道，因为它可能解释区域污染来源，作为联防联治，联防联控的技术依据。

(2)卫星遥感与地面环境数据相互印证。目前，卫星环境遥感监测已在国内多领域应用，卫星实时传输的环境数据无法修改，可与地面站数据相互印证。环保部利用国产环境一号卫星、高分系列卫星等数据，结合国外的遥感数据，实时获得PM2.5、PM10、二氧化硫、二氧化氮、灰霾、沙尘暴、秸秆焚烧等指标的监测结果。我国已经建立颗粒物遥感监测网络，分为卫星遥感和地基遥感两部分。现在京津冀区域污染监测一体化，卫星看到的是区域、水平分布，雷达看到的是污染物垂直分布，形成了区域三维立体监测网络。此外，无人机监测的手段，也可对大气污染源、违规排放等进行动态监测。

(仪器信息网)

无锡建成食品安全快检中心

不久前，无锡市食品安全快速检测实验中心建成并投入试运行。实验中心占地250 m2，分为理化实验室、无菌实验室、接样室和档案室。实验室整体布局合理，突出开放性，具备良好的透视效果，配备中央空调和新风系统，具有良好的防风、防尘、控温设施。实验室配备有拉曼光谱仪、酶标仪、细菌总数检测仪、十六合一快检仪等实验仪器，以及其它辅助仪器。建成的实验中心可对乳制品、肉制品、豆制品、粮油制品、茶叶、果蔬、蜂蜜、糖果、冷冻食品、饮料类产品、酒类产品、调味品等主要食品品种开展快速检测;具备食品主要营养指标、食品添加剂、污染物及微生物等指标的验证能力;可满足食品质量安全快速筛查的要求。

实验中心正式投入运行后，将在发现、解决食品安全风险隐患以及大型活动安全保障、食品安全应急事件处置等方面，发挥重要作用。为食品安全监管提供有效支撑，进一步保护广大市民“舌尖上的安全”。

(仪器信息网)

Analysis of Enzymolysis Polypeptide from Bombyx Batryticatus by LC-MS

Li Can1，2, Hou Lin1, Yu Ruixue3, Zhang Yujuan2
(1．College of Pharmacology of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250011, China; 3．Experiment Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

The relative molecular mass and amino acid composition enzymolysis polypeptide from Bombyx Batryticatus was analyzed. The relative molecular mass information and amino acids of enzymolysis polypeptide were identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry in positive mode using Hola C18(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm) column. The mobile phase was 0.05% formic acid water solution and 0.05% formic acid-acetonitrile solution. The relative molecular mass of enzymolysis polypeptide was 500-1 000 Da, the number of amino acid of enzymolysis polypeptide was less than 10. The LC-MS analysis platform can be used to analyze the relative molecular mass and amino acid of peptide by enzymolysis, which is in favor of the analysis of biological activity about enzymatic polypeptide.

Bombyx Batryticatus; enzymolysis polypeptide; amino acid; relative molecular mass

O657.7

:A

:1008-6145(2017)02-0011-05

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.02.003

*山东中医药科技发展计划项目(2013-060)

联系人：李灿；E-mail： licanhk@163.com

2016-01-04