耳聋的临床遗传咨询——走进基因组新医学时代

王秋菊 关静

耳聋是导致言语语言交流障碍的常见疾病，50%～70%的耳聋是由遗传因素所致[1]，随着国际人类基因组计划、人类基因组单体型图计划、千人基因组计划顺利实施，以及高通量新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）的快速发展，越来越多的研究证实了遗传因素在耳聋发生中的重要作用，对于耳聋相关基因的研究和基因诊断也进入高速发展的新阶段。自1992年发现第1个非综合征型耳聋基因至今，随着2005年之后新一代测序技术的问世，掀起了一场耳聋基因研究和发现的新热潮[2]。

遗传性耳聋是父母的遗传物质传递给后代所引起的听力损失，父母一方或双方可以是与子代表型类似的耳聋患者，也可以是听力正常的致病基因携带者。特别要强调，父母传给后代的是导致耳聋的“遗传物质”，而不是耳聋本身。因此，不能简单根据是否有耳聋家族史和是否为先天性耳聋来判断遗传性耳聋。

一旦考虑与遗传因素相关的耳聋，不仅关系到患者本人，还涉及其家庭成员。这类耳聋患者及其家庭成员除了关切患者听力损失的发展趋势和有效的治疗手段外，同时对于遗传因素是否会引起其有血缘关系的家庭其他人员罹患耳聋以及耳聋发生的风险性等问题更应关注，这就促使耳鼻喉科医生需要快速转换成为临床遗传咨询师的角色，给予专业确切的回答和降低发病风险的指导建议。

遗传咨询（genetic counseling）最早于1941年被提出，1975年美国人类遗传学学会对其赋予定义，是帮助咨询者理解遗传因素对疾病的作用，解释遗传检测结果及其在疾病诊断、治疗和预后上的意义，告知遗传方式和预测遗传风险，指导再生育方法选择的交流沟通过程（communication process）[3，4]。目前在国内尚无遗传咨询师这个职业，遗传咨询都是由专科临床医生兼任。本文根据目前常见的遗传咨询问题和现象，梳理了对于耳聋遗传咨询的认识和实践，用于指导临床。

1 聋病遗传咨询基本过程

不同类型聋病的临床诊断依赖于耳鼻咽喉科专科医生，一旦环境因素导致耳聋的病因被排除，则可从最简单的单基因病遗传模式入手进行遗传咨询。首先根据采集的患者病史和家族史，绘制家系图谱，通过分析家系图谱的遗传特性，提出最可能的遗传规律和模式。其次，指导患者及其家庭选择适当的基因检测方法，帮助寻找耳聋的致病基因。最后，对患者的基因型与临床表型信息进行综合分析，评估疾病发生、发展趋势，提供合理的指导建议，同时疏导由基因检测结果产生的患者家庭的心理问题。

2 常用基因检测方法和选择策略

耳聋具有高度遗传异质性，遗传学家估计约有250～300个基因与遗传性耳聋相关。如何帮助患者检测到真正的致病基因，临床医生选择和建议的适当基因检测方法是关键。

2.1 常见耳聋基因的检测

基于大规模不同种族的聋病分子流行病学的研究以及聋病常见基因图谱的绘制，人们已经确认GJB2、SLC26A4和mtDNA12SrRNA是我国耳聋人群中最常见的3个致病基因[5，6]，同时在健听人群中的突变携带率相对较高。2007年王秋菊首次提出新生儿听力及基因联合筛查理念[7]，历经近10年的临床实践，包含有GJB2、SLC26A4和mtDNA12SrRNA这3种基因突变位点的检测方法已广泛应用于联合新生儿听力筛查以及孕妇早中期的聋病易感基因筛查。耳聋基因筛查的应用作为一种公共健康保障措施，不仅能够早期发现先天性耳聋患者，还能发现迟发性耳聋患者和药物敏感性耳聋基因携带者，并得到遗传咨询建议和后期有效的干预，避免因聋致哑悲剧的发生，目前已成为聋病规模化防控模式的典范。但对于这3种常见耳聋基因的检测，仅能解答约36%聋病患者的致病基因。面对临床众多的聋病患者统一应用常见耳聋基因检测，将无法满足临床的实际需要，这就亟需覆盖更多耳聋基因的遗传诊断手段。

2.2 已知耳聋基因的检测方法

基因检测技术不断在发展，从最初的Sanger测序、飞行时间质谱，到新一代测序技术的出现，耳聋基因检测方法也从最初能够批量完成3个常见耳聋基因检测到现在一次检测上百个甚至更多基因的巨大技术飞跃。

新一代测序技术的目标区域测序（NGS Panel）是对选定的目标基因组区DNA富集后进行高通量测序的技术手段，类似于“智能渔网”，能将感兴趣的基因一次性捕获。2010年至今，已有多篇基于不同种族耳聋群体利用覆盖不同耳聋基因数量的NGS Panel进行耳聋遗传诊断的报道[8～10]，延展了对耳聋致病基因突变谱的重新认识，提高了对稀有变异的检测发现，最重要的是帮助了更多病因不明的耳聋患者找到真正的致病“幽灵”。目前国内市场已有针对耳聋基因的NGS Panel，检测能够覆盖到包含非综合征型耳聋及综合征型耳聋相关100～200个基因编码区及邻近剪切区，不同检测机构利用HisSeq 2000/2500/4000测序平台，提供了更深的基因覆盖度及高通量检测，为耳聋患者遗传基因的鉴定提供了更经济有效的新途径，具有巨大的临床应用潜力。

2.3 新耳聋基因的检测方法

对于常见耳聋基因筛查及已知耳聋相关基因检测均未发现可疑的致病变异个体，需再次结合患者的病史进行分析，明确遗传因素致病的权重，进一步针对可能存在的新致病基因进行挖掘。人类基因组共由大约31.6亿个碱基对组成，有180000个外显子，包含了所有蛋白质的编码序列，占人类全部基因组序列的1%[11]。2009年Nature杂志发表了国际上首次利用全外显子组测序技术（whole exome sequencing，WES）发现弗里曼谢尔登综合征（freemansheldon syndrome，FSS）致病基因的文章[11]，此后该技术广泛应用于检测包括耳聋在内的遗传性疾病基因突变。WES能够在短时间内覆盖大范围的基因型，获得更丰富、有意义的数据，结合大量公共数据库提供的外显子组数据，找到引起致病变异的可能性很高，更好地解释疾病的致病机理。

然而，任何技术方法都有其应用的局限性，目前认为85%的疾病相关突变位于外显子编码区[12]，而对于发生在非编码区的变异，以及基因组结构的变异包括拷贝数变异(copy number variations，CNVs）、颠换(inversion)、易位(translation)等，外显子测序便显得束手无策。因此，如果采用外显子测序方法，仍未能发现与表型共分离的候选致病位点，预示着致病基因有可能位于非编码区或存在基因组结构变异，深入分析可考虑采用全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）以及基于全基因组扫描的微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH）和单核苷酸多态性微阵列技术（single nucleotide polymorphism array，SNP array），在全基因组范围内搜寻疾病相关候选位点和区域。对于耳聋遗传学病因分析，由于WGS检测费用昂贵、测序覆盖整个基因组，基因变异信息解析时间长，目前主要应用于少数的科研项目。

3 聋病遗传咨询的主要群体

聋病咨询的主要内容包括耳聋发生的病因，耳聋的发展趋势和严重程度，初次（或再次）妊娠发生耳聋的风险，以及对于风险的有效防控措施。结合实际临床咨询中不同咨询者家庭背景情况和上述关注内容，可将聋病遗传咨询对象归纳为以下6类，本文案例均来自参与“中国聋病基因组计划”的咨询家庭。

3.1 孕前咨询群体：听力正常夫妻，伴单方/双方有耳聋家族史

图1 咨询者A家庭谱系图

针对耳聋再发风险的孕前咨询，首先根据咨询者描述的家族成员听力情况绘制出家系图谱，图1所示的咨询者A家庭（Ⅲ-1和Ⅲ-2）是一对听力正常（测听结果无异常）的育龄夫妻进行孕前咨询，因男方咨询者的父母均为聋哑人，且男方咨询者的母亲家族有2名耳聋患者。本案例咨询者最关注的问题是遗传因素是否会导致下一代耳聋的发生及风险性。首先需要帮助这个家庭查寻到存在的真正致病原因，再做咨询指导。

本案例中男方咨询者（Ⅲ-1）家庭中存在较高的遗传风险，其耳聋患者发生在Ⅱ代，建议男方咨询者（Ⅲ-1）的父亲（Ⅱ-3）和母亲（Ⅱ-4）采血分别进行包含有127个基因的遗传性耳聋NGS Panel检测，男方家族的其他成员（Ⅱ-1，2，5，6）采血备用验证基因变异位点。

基因检测结果（如图2所示）发现男方咨询者父亲（Ⅱ-3）的耳聋基因是SLC26A4复合杂合突变（参考序列NM_000441，c.1174A＞T杂合突变和c.1336C＞T杂合突变，突变位点是已经报道过的致病突变），男方咨询者母亲（Ⅱ-4）的耳聋基因是MYO15A复合杂合突变（参考序列NM_016239，c.7396-1G＞A杂合突变和c.4823C＞A杂合突变，突变位点均未被报道，致病属性分别为可疑致病和临床意义不明）。对于男方咨询者母亲（Ⅱ-4）基因检测发现的两个尚未报道过的变异位点，根据2015ACMG遗传变异分类标准[13]致病变异证据标准分析为致病基因突变。SLC26A4基因是常染色体隐性遗传非综合征型耳聋4型（DFNB4）致病基因，MYO15A基因是常染色体隐性遗传非综合征型耳聋3型（DFNB3）致病基因。明确了家族中聋病患者的致病基因型后，对于家族其他成员利用Sanger测序法进行检测到的基因突变位点的验证，结果发现男方咨询者（Ⅲ-1）携带了SLC26A4基因杂合突变和MYO15A基因杂合突变（见图2）。

通过上述男方咨询者（Ⅲ-1）家庭的基因检测，明确了男方咨询者存在的潜在耳聋遗传危险因素（携带SLC26A4基因杂合突变和MYO15A基因杂合突变）。对于女方咨询者（Ⅲ-2），无耳聋家族史和其他系统疾病，建议其进行81个基因的非综合征型耳聋NGS Panel检测，其中包含有2个线粒体遗传性非综合征型耳聋基因MT-RNR1和MTTS1。基因检测结果（如图2所示）显示女方咨询者（Ⅲ-2）SLC26A4基因和MYO15A基因序列均无变异，2个线粒体基因无变异。在本案例中，特别要强调对于听力正常且无耳聋家族史的女方咨询者（Ⅲ-2）一定不要忽略对于线粒体基因（mtDNA）检测，mtDNA占人体遗传信息1%，子代mtDNA是来自卵细胞，属于母系遗传。

综合咨询者双方的基因结果，可以确认有耳聋家族史的男方（Ⅲ-1）家庭为常染色体隐性遗传，尽管男方咨询者携带两个耳聋基因杂合突变位点，但其配偶（Ⅲ-2）不携带这两个耳聋基因的任何突变位点且耳聋相关线粒体基因无突变，所以子代再发耳聋的风险较低，孕前指导建议选择自然妊娠。

图2 咨询者A家庭的基因检测结果

3.2 孕前咨询群体：夫妻双方中仅有一方为耳聋患者且有耳聋家族史

图3 咨询者B家庭，男方咨询者为耳聋患者且伴有耳聋家族史，女方咨询者为听力正常

首先根据B家庭咨询者描述的家族成员听力情况绘制家系图谱，图3所示的咨询者（Ⅳ-9和Ⅳ-10）是一对育龄夫妻进行孕前咨询，男方咨询者及其家族成员中共有9名耳聋患者，听力下降开始于20～40岁之间的迟发型中重度听力损失。本案例咨询者最关注的问题是如何避免下一代耳聋再发风险。

根据图3家系图谱，可以看到男方咨询者（Ⅳ-9）的家系遗传特征：①耳聋表型在这个家系3代中连续出现，且男女均有发病；②耳聋患者的双亲中有一位为耳聋患者；符合常染色体显性遗传。在对这个家庭生育指导之前，首先需要明确男方咨询者的遗传致病基因。笔者建议男方咨询者（Ⅳ-9）进行包含127个基因的遗传性耳聋NGS Panel检测，男方的父亲（Ⅲ-6）和母亲（Ⅲ-7）以及其他成员采血备用验证基因变异位点。基因检测结果发现男方咨询者（Ⅳ-9）EYA4杂合突变（参考序列NM_172105），EYA4基因是常染色体显性遗传非综合征型耳聋10型（DFNA10）致病基因，在其家族成员进行该突变位点验证（如图4所示）存在突变疾病表型共分离现象，其中Ⅳ-7年龄30岁（无听力异常主诉，但测听显示双耳2～8 kHz对称性缓降型中度感音神经性听力下降）、Ⅴ-4年龄4岁（对声音反应良好，测听结果无异常）、Ⅴ-6年龄5岁（对声音反应良好，测听结果无异常），因此在这个案例中明确男方咨询者（Ⅳ-9）致病基因之外，对于3个（Ⅳ-7、Ⅴ-4，6）携带致病基因突变但尚未有显著听力异常的成员，需要在成年后定期检测听力变化。

常染色体显性遗传性耳聋的后代子女发病几率高达50%或以上，再发风险大。对于本案例的孕前咨询夫妻，建议通过第三代试管婴儿技术方法，利用胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）阻断家族中EYA4基因突变致聋的传递。

3.3 孕前咨询群体：聋哑夫妻，无耳聋家族史

图4 咨询者B家庭的基因检测结果

同证婚配是遗传学中一种普遍现象，聋哑夫妻的婚配模式会增加连续的遗传性状变异发生几率。图5所示的咨询者（Ⅱ-1和Ⅱ-2）是一对聋哑夫妻。其最关注的问题是下一代耳聋发生的风险。笔者建议夫妻双方（Ⅱ-1和Ⅱ-2）分别进行遗传性耳聋NGS Panel检测，双方的父母（Ⅰ-1，2，3，4）采血备用验证基因变异位点。

图5 C家庭咨询者为聋哑夫妻，双方均为家中独子/女，无耳聋家族史

基因检测结果（如图6所示）发现男方咨询者（Ⅱ-1）的耳聋基因是GJB2复合杂合突变（参考序列NM_004004，c.235delC杂合突变和c.299_300delAT杂合突变，突变位点均为已经报道过的致病突变），女方咨询者（Ⅱ-2）的耳聋基因是TMC1纯合突变（参考序列NM_138691，c.797T＞C，突变位点未被报道，致病属性是临床意义不明），笔者根据2015 ACMG遗传变异分类标准[13]致病变异证据标准分析为致病基因突变。GJB2基因是常染色体隐性遗传非综合征型耳聋1型（DFNB1）致病基因，TMC1基因是常染色体隐性遗传非综合征型耳聋11型（DFNB11）致病基因。咨询者（Ⅱ-1和Ⅱ-2）配偶双方均不携带彼此致病基因的任何突变位点，同时女方咨询者（Ⅱ-2）无耳聋相关线粒体基因突变。

综合咨询者双方的基因结果，可以确认均为常染色体隐性遗传。由于咨询者夫妻双方的致病基因不同且均不携带对方基因的任何突变位点，所以子代再发耳聋的风险较低，孕前指导建议选择自然妊娠。随后这对聋哑夫妻顺利生产一名女婴（Ⅲ-1），并顺利通过听力筛查。

图6 咨询者C家庭的基因检测结果

3.4 新生儿聋病易感基因筛查阳性家庭

2012年北京市实施了为全市新生儿自愿免费开展聋病易感基因筛查，2016年北京市卫生和计划生育委员会下发了《关于规范北京市0～6岁儿童听力与耳聋基因联合筛查诊治工作的通知》，拟于早发现、早诊断、早干预有听力障碍的儿童。当耳聋基因筛查结果显示存在突变位点（包括杂合突变或纯合突变）时，医生需要对基因结果的临床意义进行正确的解析并给予适当的咨询建议，如图7所示是2007年王秋菊教授提出新生儿听力与基因联合筛查并绘制的结果咨询要点流程图[14]，其中mtDNA突变携带者应对其本人及母系成员进行用药宣教。

图7 新生儿听力与基因联合筛查并绘制的结果咨询要点流程图

3.5 产前咨询群体：听力正常孕妇，携带常见耳聋基因突变，无耳聋家族史

在我国人群中GJB2、SLC26A4、MT-RNR1基因突变检出率约为4%～6%[15]，目前北京市多家医院在妊娠早期孕妇中开展了聋病易感基因的筛查工作，将聋病防控关口前移至产前阶段。对于筛查检出携带突变的孕妇，建议孕妇本人及其配偶同时进行3种常见耳聋基因的全序列检测，根据双方的基因检测结果进行产前咨询，对于夫妻双方携带有同一基因的相同或不同突变位点的高危携带家庭，耳聋发生风险相对增加，产前诊断可有效防止聋儿出生。

3.6 孕前/产前咨询群体：生育二孩的遗传咨询

随着我国实施全面二孩政策，要求再生育的妇女数量不断增加。对于已生育一个耳聋患儿的家庭，希望对再次妊娠的耳聋再发风险进行评估。明确咨询家庭的遗传方式和致病基因是预测胎儿受累机率的基础，从而提供正确的指导建议及有效的干预策略。

图8 生育二孩的家庭，左图为孕期咨询，右图为产前咨询

如图8所示的两个生育二孩家庭，笔者建议图中Ⅱ-1进行耳聋基因检测数量覆盖度较大的遗传性耳聋NGS Panel检测，父母（Ⅰ-1，2）采血备用验证基因变异位点。对于基因检测存在以下3种可能结果：

①Ⅱ-1致病基因明确，且父母亲（Ⅰ-1，2）是基因突变携带者：图8左侧家庭，孕育二孩的聋病再现风险度相对较高，可采取产前诊断方法，或选择PGD试管婴儿技术进行主动性防控。图8右侧家庭，二孩的聋病再现风险已客观存在，仅能采取产前诊断获悉胎儿是否存在耳聋基因型。

②Ⅱ-1致病基因明确，但父母亲（Ⅰ-1，2）均不携带突变位点：是在临床遗传咨询中的一类特殊案例，Ⅱ-1的基因突变位点属于“新生突变”（de novo mutations，DNMs）。DNMs可能来源于亲代生殖细胞的减数分裂、精卵细胞形成过程中发生的突变，也可能是在受精卵形成后发生的突变。由于二孩的聋病再现风险无法预测，建议可选择产前诊断获悉胎儿是否存在第一个孩子的耳聋基因型。

③Ⅱ-1致病基因不明确：可能存在已知耳聋基因结构变异或耳聋新基因的可能性，建议图8左侧家庭可进行WES和array-CGH/SNP array。对于图8右侧产前咨询家庭，给予医生进行致病基因分析的时间有限，无法完成进一步病因分析，建议二孩出生后监测听力变化。

3.7 咨询要点总结

根据咨询者描述的家庭成员聋病发生情况，绘制家系图谱。选择适当的基因检测方法，明确致病基因，完成遗传学基因诊断。分析遗传方式，估计发病风险并预测其子代患病风险。提供正确的遗传咨询：包括根据子代可能的再现风险度，建议采取适当的产前诊断方法，或PGD/PGS为代表的第三代试管婴儿。

4 基因检测结果的解读

基因检测不等于基因诊断，对于基因检测结果的正确解读是聋病遗传咨询的关键问题。2015年美国医学遗传学与基因组学学会（american college of medical genetics and genomics，ACMG）联合分子病理学会（association for molecular pathology，AMP）和美国病理学家协会（college of American pathologists，CAP）修订了序列变异解读的标准和指南[12]，建议使用特定标准术语描述孟德尔疾病相关的基因变异——“致病”、“可能致病”、“意义不明确”、“可能良性”和“良性”，这在一定程度上为变异位点准确解读提供了部分依据。

每个人基因组中都有4～5百万个基因变异位点，这些位点中有些是在正常个体和患者个体中均有的中性基因变异（neutral variants），有些才是致病变异位点，在人与人之间只有0.1%的序列差异中，致病性变异位点往往是在人群中罕见的或唯一的，准确和完整的临床信息对于众多临床意义不明确或存在分歧的检测结果的解读至关重要。遗传咨询医师作为解读咨询者基因密码的专业人员，需要直面遗传咨询的患者及其家庭，直面复杂的大数据检测结果，遗传咨询师除了需要懂基因，更需要懂临床，当基因检测结果只是唯一的证据时，需告知家庭变异致病的可能性，并制订出一系列可被咨询者理解和接受的精准指导和干预措施。

5 展望

随着基因检测和基因组解析技术的进步，必将推动基因检测临床普及化，更多的单基因病可以进行基因诊断并用于临床，越来越多的人也将借助基因检测技术获得疾病的早期筛查和诊断，并接受有效的防控干预指导。我们正走进一个能够应用基因组检测进行临床实践的新医学时代，大道如虹任重道远！

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