硅酮凝胶对小型猪瘢痕模型血管内皮生长因子表达的影响

黎丁菱+高彦晨+农晓琳

[摘要]目的 研究硅酮凝胶对小型猪瘢痕模型中血管内皮生长因子（VEGF）的影响，探讨医用硅酮凝胶的作用机制。方法 于2015年7～9月构建小型猪猪背瘢痕模型，随机分为空白对照组和硅酮凝胶组。硅酮凝胶组在术后28 d外用医用硅酮凝胶喷雾剂，空白对照组不作处理。术后56 d处死动物，切取猪背瘢痕，采用免疫组化的方法观察瘢痕中VEGF的变化情况。结果 硅酮凝胶组的瘢痕增生较空白对照组显著减轻。硅酮凝胶组的VEGF平均光密度值为0.034±0.081，显著低于空白对照组的0.110±0.014，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 硅酮凝胶可能通过下调VEGF而减轻瘢痕的增生。

[关键词]瘢痕；硅酮凝胶；血管内皮生长因子；动物模型

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）01（c）-0123-03

[Abstract]Objective To study the influence of Silicone Gel on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in scar model on the back of miniature pig and to explore the mechanism of action of medical Silicone Gel.Methods From July to September in 2015，the minipig back scar model was constructed and were randomly divided into the control group and the Silicone Gel group.The Silicone Gel group was given Medical Silicone Gel Spray after operation for 28 days，the control group was not treated.The animals were sacrificed after operation at 56 days，and the scar of pig back was removed.The changes of VEGF was observed by immunohistochemistry.Results Scar hyperplasia in the Silicone Gel group was significantly reduced，compared with the blank control group.The average optical density of VEGF in the Silicone Gel group was 0.034±0.081，which was lower than 0.110±0.014 in the the control group，with significant difference （P<0.05）.Conclusion Silicone Gel may reduce scar hyperplasia by down-regulation of VEGF.

[Key words]Scar；Silicone Gel；Vascular endothelial growth factor；Animal model

皮膚病理性瘢痕是创伤愈合过程中形成的一种皮肤纤维组织增生性疾病，包括增生性瘢痕（hypertrophic scar）和瘢痕疙瘩（keloid）。增生性瘢痕是临床上常见疾病，目前防治增生性瘢痕的方法很多，例如手术治疗、药物治疗和放射治疗等，但治疗效果并不十分理想，停止治疗后容易复发[1]。在分析病理性瘢痕发生机制的因素中，血管因素在瘢痕形成过程中的作用越来越受到重视。初步的研究显示，瘢痕的发生、发展、转归及预后与瘢痕组织的微血管形成及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等细胞因子过度表达紧密相关[2]。VEGF是目前已知的最强的促血管因子，具有促进细胞增殖、促进血管支持物生成等功能，且在病理性瘢痕中呈高度表达[3-4]。本研究通过建立小型猪增生性瘢痕模型，探讨硅酮凝胶喷雾剂对增生性瘢痕的作用机制及对VEGF表达的影响，为医用硅酮凝胶的应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验对象

健康雌性巴马小型猪2只（广西大学动物科学院提供，许可证号：SCXK桂2013-003），清洁级，4月龄，体重为12.0～12.3 kg。动物喂养于通风、干燥的环境中，单只分笼人工混合饲料喂养，适应性饲养7 d。

1.2主要试剂和仪器

医用硅酮凝胶喷雾剂（上海上大吉申科技开发有限公司，产品标准号：YZB/沪 1761-64-2012），兔抗VEGF多克隆一抗（北京博奥森生物技术有限公司），羊抗兔抗鼠通用型二抗、免疫组化试剂盒及DAB酶底物显示试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.3实验方法

1.3.1猪背瘢痕模型实验 术前12 h禁食，8 h禁饮，使用速眠新Ⅱ0.2 ml/kg肌内注射，待动物四肢无力后使用3%戊巴比妥钠溶液0.3 ml/kg肌内注射。动物取俯卧位，背部去毛，局部皮肤碘酒、乙醇消毒，铺巾。在小型猪背部建立猪背瘢痕模型的方法参照相关文献[5]，分别于猪背两侧建立6块瘢痕创面，损伤面积约为3 cm×3 cm，伤口止血后暴露不做其他处理。术后分圈喂养，自由进食，观察创面愈合情况，待创面自然表皮化瘢痕愈合。于术后第28天，将动物随机分为空白对照组（不加任何处理）和硅酮凝胶组，每组1只小型猪，12个创面。于创面制备术后28 d，硅酮凝胶组在猪背瘢痕处喷涂硅酮凝胶，早晚各1次，连续用药，用药期间实验动物无舔食药物等现象。小型猪连续用药28 d后（即术后第56天），处死动物并切取小型猪背部瘢痕标本，标本取自瘢痕组织中央及周围交界区。

1.3.2瘢痕组织中VEGF表达的检测（SP法） 标本在4%多聚甲醛中固定48 h后，脱水、石蜡包埋、切片，厚5 μm。石蜡切片脱蜡复水，蒸馏水冲洗，于pH为6.0的枸橼酸中行抗原热修复，PBS冲洗，3%过氧化氢孵育10 min，PBS冲洗，10%山羊血清封闭10 min，倾去加入一抗（1∶100），4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，生物素标记的二抗工作液37℃孵育15 min，PBS冲洗3次，辣根过氧化物酶标记37℃温箱孵育15 min，PBS冲洗3次，DAB染色，显微镜观察后彻底冲洗，苏木素复染返蓝，中性树酯常规封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，操作同上述步骤。将每张切片在光镜下随机选取5个高倍视野（×400），采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统以同一模式计算表达的光密度值作为其表达强度进行分析。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理，计量资料以x±s表示，两样本均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大体观察

猪背瘢痕术后14 d，创面已完全结痂；术后28 d，两组增生性瘢痕形成明显，较周边正常皮肤凸起，色暗红，质地坚硬；用药28 d后，空白对照组与术后28 d比较差异无明显变化；与空白对照组相比，硅酮凝胶组瘢痕体积减小，表面趋于平坦，质地变软，颜色与周边正常皮肤相近。

2.2两组瘢痕组织中VEGF蛋白的表达

VEGF的阳性表达主要定位于瘢痕组织的成纤维细胞、血管内皮细胞及炎性细胞的细胞质，呈棕黄色或黄色。光镜下可见硅酮凝胶组中VEGF蛋白染色后呈阳性表达，与空白对照组相比，VEGF蛋白表达水平明显降低（图1），而PBS代替一抗的阴性组中VEGF蛋白未见有阳性表达。采用IPP软件分析VEGF蛋白的平均光密度值，结果显示，硅酮凝胶组的VEGF平均光密度值为0.034±0.081，显著低于空白对照组的0.110±0.014，差异有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

病理性瘢痕是皮肤创伤愈合过程中组织修复的过度增殖，是细胞外基质过度合成并分泌的纤维化疾病，可发生于身体的任何组织，是创伤愈合后的产物，其发病机制尚未完全明确[6-7]。增生性瘢痕不但影响患者的容貌，而且产生瘢痕挛缩可导致不同程度的功能障碍，给患者带来巨大痛苦。Clark等[8]发现增生性瘢痕组织中微血管密度明显高于萎缩性瘢痕和正常皮肤，并推测瘢痕的形成可能有一定的血管依赖性。局部血管增生在病理性瘢痕的生长及复发过程中极可能发挥着关键的作用，因此可以假设抑制瘢痕及其周圍正常皮肤的血管生成将有助于抑制瘢痕生长及复发。VEGF是血管内皮细胞的强效优势分裂原，具有强烈的促血管生成作用，可促进血管内皮细胞增殖、分化，增加局部组织微血管的通透性[9]，改变细胞外基质的成分[10]。增生性瘢痕中VEGF主要由成纤维细胞、角质形成细胞分泌，其能促进多种组织的血管新生和血管内皮细胞的增殖、迁移，从而促进病理性瘢痕的形成，抑制其表达可以减少增生性瘢痕的血管生成并减少胶原合成[11]。

硅酮凝胶喷雾剂是目前临床应用于防治瘢痕的药物之一，为硅酮制剂的气雾型。临床上主要用于烧伤、创伤及外科手术后预防增生性瘢痕的形成和辅助治疗，对潜在瘢痕的增殖及创面部位的疼痛、痛痒等症状具有良好的效果[12-13]；其对增生性瘢痕效果较好，但作用机制仍未十分清楚[14]。本实验采用小型猪作为实验动物，其皮肤表皮形态学，甚至表皮细胞的更新时间都和人类的皮肤非常相近[15]，且巴马小型猪是广西地区独特的小型猪种，体型小，操作容易，遗传稳定，个体差异小，是一种理想的实验动物[16]。本实验通过构建小型猪猪背瘢痕模型，外用硅酮凝胶喷雾剂，从中观察其疗效，结果显示，在大体形态方面，硅酮凝胶组较空白对照组瘢痕面积减小，质地变软；从免疫组织化学的结果可以看出，在硅酮凝胶组中VEGF表达水平显著降低，提示硅酮凝胶能抑制猪背瘢痕模型组织中VEGF的表达。

综上所述，外用硅酮凝胶喷雾剂可以引起猪背瘢痕组织中VEGF表达水平下降，其可能通过改变瘢痕组织局部VEGF的表达水平以抑制瘢痕微血管的增生，减少瘢痕营养供给，减少胶原沉积，进而达到抑制瘢痕增生的目的，但有待进一步研究以得到更多的证据加以验证。

[参考文献]

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（收稿日期：2016-10-31 本文编辑：祁海文）