西瓜枯萎病菌拮抗枯草芽孢杆菌BTF发酵条件优化

李 萍，刘 冬，2，代玉立，高智谋

(1．安庆职业技术学院 园林园艺系，安徽 安庆 246003；2．安徽农业大学 植物保护学院，安徽 合肥 230036；3．福建省农业科学院 植物保护研究所，福建 福州 350013)

西瓜枯萎病菌拮抗枯草芽孢杆菌BTF发酵条件优化

李 萍1，刘 冬1，2，代玉立3，高智谋2*

(1．安庆职业技术学院 园林园艺系，安徽 安庆 246003；2．安徽农业大学 植物保护学院，安徽 合肥 230036；3．福建省农业科学院 植物保护研究所，福建 福州 350013)

为提高拮抗细菌对西瓜枯萎病菌的拮抗作用，应用单因素和响应面对拮抗枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件进行优化。结果表明，最适发酵培养基为葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L，磷酸二氢钾5 g/L。最佳发酵培养的时间为60 h，初始pH为7.0，接种量、培养温度和转速分别为9.95%、36℃和120 r/min。在该条件下进行验证，抑菌率为62.12%，可作为西瓜枯萎病生物防治的潜在微生物制剂选项。

西瓜枯萎病菌；拮抗细菌；响应面；发酵条件优化

尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusarium oxysporum Schl. f.sp. niveum ( E.F. Smith) Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病是一种世界毁灭性的土传病害，该病于1894年Smiht首次报道，广泛分布于非洲、澳大利亚、亚洲、欧洲、北美和南美等国家，现已上升为主要病害[1-3]。西瓜枯萎病防治十分困难，选育和利用抗病品种是最经济有效的措施。目前生产上既抗枯萎病又高产优质的西瓜品种很少，常采用轮作换茬、嫁接和化学药剂等方法防治枯萎病。实行多年轮作倒茬的农业措施，对减少病害传播虽能起到一定的作用，但有些地区土地有限，轮作不易实施[4]；嫁接栽培能明显降低枯萎病的发病率和病情指数，但费工费时并降低了西瓜的品质和风味，限制了这一技术在生产实践中的广泛应用；化学药剂防治可以收到一定的效果，但成本高、用工多，且造成农药残留和大气污染，使化学防治失去其应有的效力[5]。生物防治方法对环境友好，风险低，其中，微生物源生物农药研究和开发十分活跃，但潜力尚没有得到充分的发挥，作为低毒性新型农药其具有重要的开发价值[6-7]。

目前，细菌中的芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonas spp.)，真菌中的绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，放线菌中的链霉菌 (Streptomyces spp.)等对西瓜枯萎病菌都有一定程度的抑制效果。王卿等[8]发现2株B. subtilis和1株多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa )对西瓜枯萎病的防治效果优于化学药剂百菌清，田间防效达64.9%。陆楚月等[9]探究了T. viride对西瓜枯萎病的防控效果，结果表明T. viride对西瓜枯萎病的防控效果达到60%。李欢等[10]发现西瓜种子与放线菌拌种处理，对苗期西瓜枯萎病的防控效果达52.17%。Faheem等[11]将猪粪与链霉菌YCXU堆肥发酵后，发现对盆栽西瓜枯萎病的防效达67%。甘良等[12]开展了放线菌混合菌剂对西瓜枯萎病的防治作用研究，结果发现混合菌剂对西瓜植株鲜重的提升和西瓜枯萎病的防治效果明显优于单个菌株。

本实验从健康的西瓜根际土壤中筛选一株对西瓜枯萎病菌具有较好拮抗作用的细菌BTF，经形态、生理生化特征和16S rDNA序列鉴定为枯草芽孢杆菌。为进一步提高生防效果，采用单因素和响应面对拮抗细菌的发酵培养基和发酵条件进行优化，对生防细菌的推广应用及抑菌活性物质的提取均有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌BTF(Bacillus subtilis)和西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. niveum.)由安徽农业大学植物病理实验室保存。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、水10 mL，pH自然。发酵基础培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、葡萄糖10 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株BTF对病原菌抑制率测定 采用平板对峙法，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中央接种6 mm培养5 d的西瓜枯萎病菌，并在距病原菌菌落中央2.5 cm处注入50 ul拮抗菌发酵液，以只接种西瓜枯萎病菌作为对照，26～28℃条件下培养，待对照菌落菌丝即将布满整个平板时，测量菌落之间的距离，计算抑菌率，抑制率(%)=[(对照菌落直径―处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100。

1.2.2 发酵培养基成分优化

(1)氮源的筛选。以硫酸铵、大豆蛋白胨和酵母膏作为氮源取代发酵基础培养基中的蛋白胨配置成3种不同发酵培养基，并以蛋白胨为氮源的基础培养基作为对照。以2%的接种量接种至4种发酵培养基中(250 mL三角瓶装液50mL)，30 ℃ 180 r/min振荡培养72 h，设3次重复。72 h后，测定拮抗菌对病原菌的抑制率，根据抑制率确定发酵培养基优化的最佳碳源。

(2)碳源的筛选。以蔗糖、可溶性淀粉和乳糖作为碳源取代发酵基础培养基中的葡萄糖配置成3种不同发酵培养基，并以葡萄糖为碳源的基础培养基作为对照。其他条件同上，根据抑制率确定发酵培养基优化的最佳氮源。

(3)无机盐筛选。添加磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化锌到发酵基础培养基中作为无机盐，并以发酵基础培养基为对照，测定抑制率。

1.2.3 发酵条件优化 采用单因素法对枯草芽孢杆菌BTF菌株发酵时间和初始 pH进行优化。发酵时间分别为24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，初始pH分别为6.5、7.0和7.5。综合单因素试验利用Box-Behnken试验设计对发酵温度、转速和接种量进行优化，并用Design-expert 10.0对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 氮源及其含量对抑菌率的影响

氮源及其含量对抑菌率的影响结果如图1所示。相同浓度下以硫酸铵作为氮源与大豆蛋白胨、蛋白胨和酵母膏相比抑菌率最低。氮源在4～8g/L范围内随着大豆蛋白胨、蛋白胨和酵母膏添加量的增加抑菌率呈增加趋势，当酵母浓度继续增加时抑菌率呈下降趋势。当蛋白胨浓度为10g/L时，其抑菌效果与12g/L的大豆蛋白胨相当(约为46%)，为节约原料选择浓度为10g/L的蛋白胨作为氮源。

2.2 碳源及其含量对抑菌率的影响

以蔗糖、可溶性淀粉和乳糖替换NA培养基中的葡萄糖，考察碳源及其含量对抑菌率的影响，结果如图2所示。在相同浓度下，与对照(葡萄糖)相比，上述三种碳源的抑菌率均较葡萄糖低。在5～20g/L范围内，抑菌率与碳源浓度呈正相关性。当碳源浓度大于20g/L时抑菌率与碳源浓度呈负相关性，即最适碳源为葡萄糖，其浓度为20g/L。

图1 不同氮源及浓度下的抑菌率 图2 不同碳源及浓度下的抑菌率

2.3 无机盐及其浓度对抑菌率的影响

无机盐及其浓度对抑菌率的影响如图3所示。与对照相比，添加1～7g/L的硫酸镁和氯化锌对抑菌率几乎无影响。与对照相比，添加3～7g/L的磷酸二氢钾可不同程度地提高抑菌率。当磷酸二氢钾的浓度为5g/L时，抑菌率最大值为55.6%，较对照提高了8.4%。

图3 不同无机盐及浓度下的抑菌率 图4 不同培养时间及初始pH下的抑菌率

2.4 培养时间和初始pH对抑菌率的影响

在36～60h范围内，抑菌率呈上升趋势，而在60～72h范围内抑菌率呈下降趋势(图4)，即适宜的培养时间为60h。此外，pH为7.0时抑菌率最大值为54.7%，较pH为6.5(48.5%)和7.5(45.7%)时的最大值分别高6.2%和9%，即适宜的pH为7.0。

2.5 Box-Behnken试验

选择转速、接种量和温度按表1进行Box-Behnken试验，结果见表1，利用Design-expert 10.0对试验数据进行分析如表2所示。对抑菌率的影响程度接种量>培养温度>转速，且接种量和培养温度对抑菌率有显著(P<0.05)影响。回归方程为：Y=56.94+0.37A+0.91B+2.41C-0.85AB-1.04AC-0.23BC+2.87A2-2.76B2-0.83C2。

表1 Box-Behnken试验设计与结果

对模型回归系数和试验结果进行方差分析(表2)，Pmodel=0.0006，回归方程显著；失拟项概率Plose=0.9552﹥0.05，无失拟因素存在；R2=0.9554和R2Adj=0.8981，表明方程能较好的反应所选参数与抑菌率之间对应。变异系数(CV)=1.63%表明方程具有良好的重现性[13]，根据方程任选3因素中的两个因素为变量，另一因素位于中心点作图5。由图可知，方程存在极大值点(抑菌率约为62.1%)，此时接种量、培养温度和转速分别为9.95%、36℃和120 r/min。在该条件下进行验证，抑菌率为62.0%与方程预测值吻合。

表2 二次多项式模型回归系数估计和试验结果方差分析

图5 转速、温度和接种量的交互作用响应面

3 结论与讨论

目前，常用的微生物发酵优化方法包括单因素试验、正交设计、Plackett-Burman设计、最陡爬坡设计和响应面设计等。单因素试验较为繁琐，正交设计无法找出整个区域上的所有因素最佳组合，Plackett-Burman设计受微生物的适应范围影响，最陡爬坡设计只能确定最优发酵条件的大概范围，而响应面法试验能较全面反映多因素水平的效果[14-16]。

枯草芽胞杆菌是生物防治中应用较为广泛的拮抗细菌，但不同枯草芽胞杆菌在发酵过程中受营养和环境条件影响很大[17]。本研究利用单因素和Box-Behnken试验对西瓜枯萎病菌拮抗枯草芽孢杆菌发酵条件进行优化，得最适碳源为葡萄糖20 g/L，氮源为蛋白胨10 g/L。添加浓度为5 g/L磷酸二氢钾的可提高抑菌率，最适的培养时间为60 h，pH为7.0，接种量、培养温度和转速分别为9.95%、36℃和120 r/min。而相关研究[18-19]表明有些枯草芽孢杆菌菌株的最优碳源为葡萄糖、最优氮源为大豆饼粉和硫酸铵；鞠瑞成[20]等研究发现尖镰孢菌拮抗枯草芽孢杆菌发酵的的最优接种量为4%，与本研究不同。有研究发现筛选芽孢杆菌对番茄枯萎病菌具有较好抑制效果的初始pH为7.0[21]，与本研究结果一致。本研究在优化条件下，枯草芽孢杆菌对西瓜枯萎病菌的抑制率达62.12%，可作为尖孢镰刀菌生物防治的潜在微生物制剂选项。

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(编辑：严佩峰)

Optimization of Fermentation Conditions for Antagonistic Bacteria BTF Against Fusarium oxysporum f.sp. niveum

LI Ping1，LIU Dong1，2，DAI Yu-li3，GAO Zhi-mou2*
(1. Department of Horticulture and Landscape, Anqing Vocational and Technical College, Anqing 246003, China;2. College of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;3. Institute of Plant Protection, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China)

Single factor experiments and response surface design were used to optimize the medium components and fermentation conditions of Bacillus subtilis strain BTF to increase its antagonistic effect against Fusarium oxysporum f.sp. niveum. The result showed that the optimize medium was glucose 20 g/L, peptone 10 g/L, KH2PO4 10g/L. The optimize fermentation conditions were fermentation time 60 h, initial pH 7.0, inoculation rate 9.95%, incubation temperature 36.00 ℃ and rotate speed 120 r/min. Inhibitory effect of strain BTF is up to 68.0% under the optimize fermentation conditions, which could be used as a potential biological control agent against watermelon Fusarium wilt.

Fusarium oxysporum f.sp. niveum; antagonistic bacteria; response surface; fermentation condition optimization

2016-11-16

安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2015A368、KJ2013B133、KJ2014A148)；安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2016516).

李 萍(1985—)，女，安徽安庆人，副教授，博士，主要从事植物真菌病害研究.

*通讯作者：高智谋(1957—)，男，安徽桐城人，教授，博士，主要从事植物真菌病害研究.

S436.42

A

2095-8978(2017)01-0099-05